determinación del efecto de un extracto estandarizado de

Transcrição

Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Kinesiología
“DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE UN
EXTRACTO ESTANDARIZADO DE VITIS
VINIFERA EN LA ACTIVIDAD VASOMOTORA
DE AORTAS DE RATAS”
Juan José Marimán Rivero.
Daniela Paz Matesic Quiroga.
2004
1
“Determinación del efecto de un extracto estandarizado de Vitis vinifera en la
actividad vasomotora de aortas de ratas”
Tesis
Entregada a la
UNIVERSIDAD DE CHILE
En cumplimiento parcial de los requisitos
para optar al grado de
LICENCIADO EN KINESIOLOGIA
FACULTAD DE MEDICINA
Por
Juan José Marimán Rivero
Daniela Paz Matesic Quiroga
2004
DIRECTOR DE TESIS:
Sandro Bustamante
PATROCINADOR:
Sylvia Ortiz Zúñiga
2
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE CHILE
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE LICENCIATURA
Se informa a la Escuela de Kinesiología de la Facultad de Medicina, que la Tesis de
Licenciatura presentada por los candidatos:
Juan José Marimán Rivero
Daniela Paz Matesic Quiroga.
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para
optar al grado de Licenciado en Kinesiología, en el examen de defensa de Tesis
rendido el 6 de Enero de 2005
DIRECTOR DE TESIS
Sandro Bustamante Delgado
...............................
COMISIÓN INFORMANTE DE TESIS
Sylvia Ortiz
..................................
Gladys Tapia
..................................
Soledad Bollo
..................................
3
A mi familia, por sus consejos y constante preocupación
A la Mate, por su compromiso a toda prueba con la tesis
A mis amigos, por soportar todos mis momentos de estrés y compartir mis alegrías
A Los Jaivas, por entretenerme en cada experimento
Y a Dios, por darme la oportunidad de vivir para terminar por fin esta tesis
Juanjo
A mi familia, a todos los que intentan comprenderme, a mis amigo(a)s, a mi gran
ponderada buena y mala suerte y, por supuesto, a mi gran compañero de tesis.
Mate
4
Agradecemos primero que todo a Don Juan, quien siempre desinteresadamente nos
brindó ayuda. A todos los profesores del laboratorio de Farmacodinamia y
Fitofarmacología: a Sandro Bustamante por su paciencia y disposición, a la trilogía
de los profesores Roberto Gallardo, Miguel Morales y el cubanito que siempre nos
alentaban. Al profesor Ramón Rodrigo por su buena disposición y ayuda en la
corrección de la tesis. Al encargado del agua destilada. A nuestros compañeros,
familiares, amigos y a todos los que hicieron posible la realización de nuestra tesis.
5
INDICE
ABREVIATURAS .........................................................................................................I
RESUMEN ..................................................................................................................II
ABSTRACT ................................................................................................................III
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................1
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................3
•
Endotelio vascular, fisiología y farmacología ...................................................3
•
Actividad vasomotora del músculo liso vascular ..............................................3
o Mecanismos de contracción del músculo liso .......................................3
o Agentes vasoconstrictores ....................................................................4
o Mecanismos de relajación del músculo liso ..........................................5
o Agentes vasodilatadores .......................................................................6
•
Flavonoides y antocianinas, propiedades terapéuticas ...................................7
•
Farmacología de los flavonoides y antocianinas en particular .........................9
o Farmacocinética ....................................................................................9
o Efectos farmacológicos en la actividad endotelial vascular y
vasomotora del músculo liso ...............................................................10
OBJETIVOS ..............................................................................................................13
•
Generales .......................................................................................................13
•
Específicos .....................................................................................................13
HIPÓTESIS ...............................................................................................................14
MATERIALES Y MÉTODO .......................................................................................15
•
Método ...........................................................................................................15
o Población de estudio ...........................................................................15
o Tipo de estudio ....................................................................................15
o Diseño de investigación .......................................................................15
o Variables ..............................................................................................15
o Criterios de inclusión y exclusión .........................................................16
o Diseño experimental ............................................................................16
•
Materiales .......................................................................................................18
o Recurso físico ......................................................................................18
6
o Animales ..............................................................................................18
o Reactivos, soluciones y fármacos .......................................................18
o Equipos e instrumentos .......................................................................18
•
Procedimiento ................................................................................................19
o Obtención y preparación de anillos aórticos torácicos de rata ............19
o Contracción con FE o solución despolarizante ....................................20
o Relajación endotelio dependiente con EVvA .......................................20
o Relajación endotelio independiente con EVvA en anillos
precontraídos con FE ...........................................................................20
o Relajación endotelio independiente con EVvA en anillos
precontraídos con solución despolarizante ..........................................21
o Contracción por Ca2+ ...........................................................................21
•
Análisis estadístico .........................................................................................22
RESULTADOS ..........................................................................................................23
•
Relajación endotelio dependiente ..................................................................23
•
Relajación endotelio independiente en anillos aórticos
precontraidos con FE .....................................................................................23
•
Relajación endotelio independiente en anillos aórticos
precontraidos con solución despolarizante ....................................................23
•
Contracción inducida por Ca2+ .......................................................................24
DISCUSIÓN ..............................................................................................................25
CONCLUSIONES .....................................................................................................29
PROYECCIONES .....................................................................................................30
REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA ...........................................................................31
ANEXO .....................................................................................................................37
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema movimientos Ca2+ en el músculo liso .........................................37
Figura 2. Esqueleto general básico de un flavonoide ...............................................38
Figura 3. Esqueleto general de una antocianina y sus variedades ...........................38
Figura 4. Esqueleto general de flavonol, flavona y flavanol .......………………….….39
Figura 5. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos
aórticos con endotelio
precontraídos con FE ..............................................41
aórticos sin endotelio precontraídos con FE ...................................................43
aórticos con y sin endotelio precontraídos con FE .........................................44
aórticos sin endotelio precontraídos con solución despolarizante ..................46
aórticos sin endotelio precontraidas con FE y solución despolarizante .........47
Figura 10. Contracción relativa inducida por Ca2+ en anillos
aórticos pre y post incubación con EVvA .......................................................49
8
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Relajación relativa inducida por EVvA en
anillos aórticos con endotelio precontraídos con FE ......................................40
anillos aórticos sin endotelio precontraídos con FE .......................................42
anillos aórticos sin endotelio precontraídos con solución despolarizante ......45
Tabla 4. Contracción relativa inducida por Ca2+ en
anillos aórticos sin endotelio pre y post incubación con EVvA .......................48
9
ABREVIATURAS
EVvA: extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon estandarizado al
0,02% de malvidin-3-glicósido
AA: anillos aórticos de rata
FE: fenilefrina
K+: potasio
Ca2+ : ion calcio
NO: óxido nítrico
PGI2: prostaciclina
IP3: inositol trifosfato
DG: diacilglicerol
ATP: adenosin trifosfato
GMPC: guanilato monofosfato cíclico
AMPC: adenilato monofosfato cíclico
EDHF: factor de hiperpolarización derivado de endotelio
ACh: acetilcolina
KHm: solución Krebs-Henseleit modificada
KHm-K+: solución despolarizante alta en potasio
10
RESUMEN
Las enfermedades cardiovasculares son un problema de salud a nivel mundial
debido a su alta morbimortalidad. Se ha observado en países como Francia, que una
dieta rica en colesterol no se correlaciona con una mayor incidencia de
enfermedades cardiovasculares, presuntamente debido a la ingesta simultánea de
vino, frutas y verduras. Esto ha motivado una serie de investigaciones que describen
las propiedades farmacológicas de los flavonoides (presentes en la uva y otros
vegetales) como agentes antioxidantes, antitrombóticos, antiinflamatorios, etc., pero
cuyos mecanismos aún no están completamente dilucidados.
El objetivo de esta tesis fue determinar el efecto del extracto de Vitis vinifera,
variedad Cabernet Sauvignon estandarizado al 0,02 % de malvidin-3-glicósido
(EVvA), en la función vasomotora de anillos aórticos (AA) de rata. Para esto se
montaron anillos aórticos en un sistema transductor de fuerza-desplazamiento para
la determinación de la variación de la magnitud de contracción isométrica ante
distintas situaciones experimentales. Se cuantificó la respuesta de la función
vasomotora con EVvA (0,1 a 1000 ng/mL) en AA con y sin endotelio, precontraídos
con fenilefrina (FE) (1µM), observándose una vasorrelajación concentracióndependiente, sin diferencias (p>0,05) entre los AA con y sin endotelio.
AA
precontraídos máximamente con solución despolarizante (70 mM K+) mostraron
similar
resultado;
vasorrelajación
endotelio
independiente
y
la
curva
de
vasorrelajación inducida por EVvA (0,1 a 1000 ng/mL) no difieren estadísticamente
(p>0,05) de lo observado en AA precontraídos con FE (1µM). Al realizarse una curva
de contracción inducida por Ca2+ en ausencia y presencia de 500 ng/mL de EVvA se
observó una disminución del efecto máximo y un desplazamiento no paralelo,
respecto del control.
De nuestros resultados podemos concluir que EVvA ejerce un efecto
vasorrelajador concentración-dependiente en los AA precontraídos con FE y
solución despolarizante. Este efecto es independiente de la presencia de endotelio,
lo que se explicaría por una disminución en el flujo de entrada de Ca2+ hacia la
célula
muscular
lisa,
probablemente
por
una
interacción
antagonista con el canal de Ca2+ tipo L voltaje dependiente.
11
farmacodinámica
Palabras claves: función vasomotora, músculo liso vascular, canales de Ca2+,
Vitis vinifera,
antocianinas.
ABSTRACT
Cardiovascular diseases are the most important health issues world wide due
to its high morbidity and mortality rates. It has been observed in some countries like
France that rich cholesterol diet is not necessarily correlated with a great occurrence
of cardiovascular diseases. Mediterranean diet is proposed as explanation, by
considering the high intake of fruits, vegetables and red wine. This assumption has
motivated scientific research in order to describe pharmacological properties of
flavonoids such as antioxidant, antiinflamatory, antithrombotic, etc., although precise
mechanisms are still not completely elucidated.
The aim of this thesis was to determine the pharmacological effect of a Vitis
vinifera extract, obtained from a Cabernet Sauvignon variety, standardized by its
content of 0.02% of malvidin-3-glicoside, on the vasomotor response of rat aortic
rings. Isometric contractions of aortic rings under different experimental conditions
were determined using force transducers attached to a polygraph. Aortic rings with
and without endothelium were precontracted with Phenylephrine (FE), 1µM, and then
were exposed to EVvA (0.1 a 1000 ng/mL) to determine smooth muscle response.
Relaxation observed was concentration-dependent with no difference between aortic
rings with or without endothelium (p>0.05). Aortic rings contracted with a high
potassium (70 mM K+) Krebs solution, showed similar relaxation patterns as those
described above. Curves of aortic contraction developed by stepwise increment of
calcium concentration (1×10-5 M - 3×10-3M) were modified by the addition of 500
ng/mL of EVvA, showing a decrease of maximal response and a no-parallel right
ward shift.
Our results suggest that EVvA exerts a concentration-dependent relaxing
effect on aortic rings previously contractes either FE or high potassium solution. This
effect seems to be not endothelium-dependent and probably due to an antagonist
effect on calcium influx to the smooth muscle cell. It is possibly that L-type calcium
channels could be involved.
12
Key words: Vasomotor function, vascular smooth muscle, Calcium channels, Vitis
vinifera, anthocyanins.
13
INTRODUCCIÓN
La enfermedad cardiaca coronaria es la primera causa de muerte en los
países industrializados, por lo que la búsqueda de aquellos factores potenciales que
predisponen a su desarrollo y determinan su evolución han generado gran interés
durante las décadas pasadas (Klatsky y cols, 1992).
Desde comienzos de la década de los 70, ha aumentado la evidencia que
demuestra que el consumo de cantidades moderadas de vino tinto está
inversamente correlacionado con la mortalidad por infarto al miocardio (Klatsky y
cols, 1981; Friedman y cols, 1986; Rimm y cols, 1991; Klatsky y cols, 1992).
St. Leger y cols (1979) fueron los primeros en demostrar una fuerte relación inversa
entre el consumo del vino y la mortalidad por la enfermedad cardíaca isquémica
basada en datos epidemiológicos de 18 países desarrollados. Sus resultados fueron
confirmados por análisis restrospectivos posteriores (La Porte y cols, 1980; Criqui y
cols, 1994). Paralelamente, se demostró que, en la población de Francia y Suiza, a
pesar de existir una distribución similar de factores de riesgo coronarios tales como
presión arterial alta, hipercolesterolemia, alto índice de masa corporal y tabaquismo,
la mortalidad por enfermedad cardiaca coronaria era más baja en comparación a
otros países industrializados. Estos resultados fueron correlacionados positivamente
con una ingesta elevada de vino en los países mencionados (Renaud y cols, 1992),
fundamentando la llamada “paradoja francesa”.
Estos hallazgos motivaron la búsqueda e investigación de los compuestos del
vino tinto responsables de los efectos observados. Se ha señalado que los
flavonoides del vino tinto producen, al menos en parte, el efecto cardioprotector
(Dell’ Agli y cols, 2004). Sabemos que estas sustancias exhiben varios efectos
biológicos tales como la inhibición de la agregación plaquetaria, estabilización de
radicales libres, prevención de la proliferación celular y disminución de los niveles de
lipoproteínas de baja densidad en el plasma (Nijveldt y cols, 2001). Además, y en
relación con nuestro estudio, se ha descrito que los flavonoides pueden modular el
tono de los vasos, favoreciendo la capacidad de relajación del músculo liso vascular
1
(Fitzpatrick y cols., 1993; Andriambeloson y cols, 1998). Sin embargo, los
mecanismos por los cuales producen su efecto vasorelajador siguen siendo
controversiales (Andriambeloson y cols, 1997), existiendo cierta evidencia que
señala una acción vasomotora constrictora o relajadora dependiendo de la
estructura química del flavonoide ensayado (Chan y cols, 2000).
Hoy en día, existe enorme difusión y popularidad
de las terapias
complementarias en el mundo. Es así como la utilización de nuevas herramientas
terapéuticas, como los fitofármacos, parecen estar ganando terreno. Entre sus
ventajas podemos mencionar que corresponden a productos naturales, no de
síntesis, que pueden llegar a no guardar diferencia en su aspecto y calidad con los
medicamentos alopáticos tradicionales. Es más, los fitofármacos poseen rangos
terapéuticos más amplios lo cual los hace difícil alcanzar la concentración mínima
tóxica para llegar a un efecto nocivo para la salud; además de poseer escasos
efectos secundarios.
Las antocianinas corresponden a uno de los grupos de flavonoides más
importantes, que destaca del punto de vista fisicoquímico por su solubilidad en agua
y su muy baja toxicidad. Presentan ventajas comparativas con respectos a otros
flavonoides, como las proantocianinas, en aspectos tan disímiles como su
farmacología o su costo de producción, por lo que puede constituir un fármaco de
fácil acceso y libre consumo para la población en general (Muñoz, 2003).
Aquellos fitofármacos constituidos principalmente por flavonoides pueden
presentarse, en un futuro cercano, como una alternativa terapéutica de prevención y
tratamiento en todas aquellas enfermedades que guarden relación con la disfunción
endotelial.
De esta manera, nos parece pertinente investigar la presunta relación
existente entre los flavonoides en general, y las antocianinas en particular, con la
actividad vasomotora, la cual se ve alterada en pacientes que padecen
enfermedades cardiovasculares.
2
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Endotelio vascular, fisiología y farmacología.
El endotelio es una monocapa de células que recubre el interior de todos los
vasos sanguíneos. La estructura celular endotelial, así como su integridad funcional
son importantes en la mantención de la pared vascular y la función circulatoriahemostasia al constituir una interfase no trombogénica entre la sangre y el tejido
subyacente, regulando los procesos de trombosis, trombólisis, agregación
plaquetaria, el tono vascular y el flujo sanguíneo; además tiene funciones
metabólicas y sintéticas, como la incorporación y metabolización de LDL y
producción de factores de crecimiento. Todas estas actividades están mediadas por
su acción autocrina, paracrina y endocrina. Su inadecuada respuesta está
involucrada en el desarrollo de muchas enfermedades, como la ateroesclerosis,
hipertensión arterial y pulmonar, sepsis y síndromes inflamatorios, lo que se
relaciona con un daño o disfunción endotelial (Galley y Webster, 2004).
El
endotelio
produce
un
número
de
sustancias
vasodilatadoras
y
vasoconstrictoras que regulan el tono vasomotor, así como el reclutamiento y la
actividad
de
células
inflamatorias
y
trombosis
(Vane
y
cols.,
1990).
El NO, la PGI2, el factor hiperpolarizante derivado de endotelio (todas sustancias
vasodilatadoras) y el péptido vasoconstrictor endotelina son sintetizados y liberados
por el endotelio en respuesta a una serie de estímulos mecánicos y neurohumorales,
lo que produce importantes efectos en la estructura y función del músculo liso
subyacente (Galley y Webster, 2004).
Actividad vasomotora del músculo liso vascular, fisiología y farmacología
Mecanismo de contracción del músculo liso
El músculo liso está presente en la pared de varios órganos y tubos del
cuerpo, incluido los vasos sanguíneos. Cuando éste se contrae, produce el
desplazamiento de su contenido luminar o la variación de su diámetro, regulando el
flujo de su contenido. El estado contráctil del músculo liso esta controlado por
3
hormonas, agentes autocrinos/paracrinos, y otras señales químicas locales, así
como también en respuesta a cambios en la carga o largo del mismo (Webb, 2003).
Para que la contracción ocurra, la miosina kinasa de cadena liviana debe
fosforilar la cadena liviana 20-kDa de la miosina, lo que posibilita la interacción de la
miosina con la actina, y el acortamiento muscular posterior. La energía en forma de
ATP proveniente desde la miosin ATPasa asegura el entrecruzamiento cíclico de la
miosina con la actina. Esta actividad contráctil está determinada por el estado de
fosforilación de la cadena liviana de la miosina, lo cual es altamente regulado. En
algunos casos, el estado de fosforilación de la cadena liviana de la miosina es
mantenido en un nivel bajo continuo, lo que permite hablar de un tono basal del
músculo liso (Webb, 2003).
La actividad contráctil del músculo liso vascular está determinada finalmente
por la concentración intracelular de Ca2+, y por la sensibilidad de los elementos
contráctiles al Ca2+. Ante estímulos específicos, la concentración intracelular de Ca2+
se ve incrementada, y éste se une con la proteína calmodulina para formar un
complejo
molecular
que
activa
la
miosina
quinasa
de
cadena
liviana,
desencadenando la contracción. El incremento en la concentración intracelular de
Ca2+ se debe a la salida de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico, así como a la
entrada de Ca2+ desde el espacio extracelular a través de canales de Ca2+ voltaje
dependiente, canales catiónicos no selectivos, la entrada de Ca2+ producida por
Ca2+ y la entrada de Ca2+ a través del intercambiador Na+/Ca2+ en modo inverso
(Karaki y cols, 1997).
Agentes vasoconstrictores
Ciertos agonistas, como la norepinefrina y la endotelina, producen la
contracción del músculo liso vascular estimulando la actividad de la fosfolipasa C.
Esta enzima cataliza la formación de dos segundos mensajeros, el IP3 y el DG. La
unión del IP3 a receptores del retículo sarcoplásmico produce la liberación de Ca2+;
por su parte, el DG en presencia de Ca2+ activa la proteína quinasa C la cual fosforila
proteínas específicas en el músculo liso, como los canales de Ca2+ tipo L,
4
promoviendo así la contracción muscular. Fármacos agonistas α-adrenérgicos
(fenilefrina y norepinefrina) producen una contracción que cursa con dos fases en el
tiempo; la primera fase, transiente, se desarrolla rápidamente (menos de 1 minuto),
con un ascenso en la curva tensión v/s tiempo debido a la salida de Ca2+ desde el
retículo sarcoplásmico hacia el citoplasma. El aumento de la concentración
intracelular de Ca2+ produce un cambio en el potencial transmembrana que induce la
apertura de los canales de Ca2+ voltaje dependiente, permitiendo la entrada masiva
de Ca2+ extracelular, lo que produce una segunda fase de contracción, mantenida en
el tiempo, contracción que se sostiene mientras está presente el estímulo
farmacológico (Karaki y cols, 1997) (Figura 1a).
El músculo liso también responde a soluciones despolarizantes, como
soluciones salinas con alto contenido de K+, las cuales producen una contracción
sostenida en el tiempo, similares a la segunda fase de contracción mencionada
anteriormente, como consecuencia de una despolarización de la membrana celular
que genera, consecutivamente, la entrada de Ca2+ por apertura de sus canales
voltaje dependientes y la activación del mecanismo contráctil
(Karaki y cols, 1997)
(Figura1b).
Mecanismo de relajación de músculo liso
La relajación del músculo liso vascular ocurre como resultado de la remoción
de estímulos contráctiles o por la acción directa de sustancias que inhiben el
mecanismo contráctil, como el factor atrial natriurético (Webb, 2003). El mecanismo
que permite la relajación requiere la disminución de la concentración intracelular de
Ca2+, además del incremento de la actividad de la miosin fosfatasa de cadena
liviana, la cual remueve los fosfatos de alta energía de la miosina y produce la
relajación muscular (Barany, 1996; Fukata y cols, 2001; Mitchell y cols, 2003). La
actividad de esta fosfatasa está regulada por un complejo molecular denominado
RhoA/Rho quinasa, cuya actividad es sensible a Ca2+. La Rho quinasa fosforila una
subunidad de unión a miosina de la miosin fosfatasa de cadena liviana, inhibiendo su
actividad y promoviendo la fosforilación de la cadena liviana de la miosina,
bloqueando la contracción muscular.
5
La disminución de la concentración intracelular de Ca2+ involucra tanto al
retículo sarcoplásmico como a la membrana plasmática. A nivel del retículo
sarcoplásmico, la enzima Ca2+-Mg2+-ATPasa, cuando es fosforilada, captura dos
iones Ca2+ y los trasloca hacia el lado luminal del retículo sarcoplásmico,
liberándolos y disminuyendo así la concentración citosólica de Ca2+ (Webb, 2003). A
nivel de la membrana plasmática existen, además de Ca2+-Mg2+-ATPasas, otras
proteínas como el intercambiador Na+/Ca2+ que ayuda a disminuir la concentración
intracelular de Ca2+. Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje o dependientes de
receptor son importantes en el flujo intracelular de Ca2+, y su bloqueo produce
vasorrelajación (Webb, 2003).
No sólo la disminución del Ca2+ intracelular relajaría el músculo liso, sino
también un proceso de desensibilización del sistema proteico contráctil y, además,
una activación de otras proteínas funcionales, como canales de K+, que
hiperpolarizando la célula muscular, bloquearían los canales de Ca2+, dando cuenta,
en parte, de los efectos vasodilatadores (Bolotina y cols., 1994).
Agentes vasodilatadores
Numerosos artículos destacan el rol vasorrelajante del NO en el músculo liso
(Sato y cols, 1990; Moncada y cols, 1991; Sanders y
Ward, 1992; Stark y
Szurszewski, 1992; Lincoln y cols.,1996; Toda y Okamura 1996). A la luz de estas y
otras investigaciones se sabe que el NO es un potente activador de la guanilato
ciclasa, la cual produciría una disminución de la concentración intracelular de Ca2+ y
un bloqueo en el mecanismo contráctil en el músculo liso, todo esto mediado por
GMPc. Dependiendo del tejido, genotipo y fenotipo, el GMPc puede afectar la
concentración intracelular de Ca2+ a través de cuatro diferentes mecanismos: (1)
reduciendo el influjo de Ca2+, (2) aumentando la salida de Ca2+, (3) promoviendo el
secuestro de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico, y (4) disminuyendo la movilización
de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico.
6
Se han descrito otras vías de vasodilatación dependientes de endotelio. Una
de éstas incluye a un prostanoide, la PGI2, que es sintetizado por la enzima
ciclooxigenasa a partir de ácido araquidónico. Esta vía de acción endotelio
dependiente actúa sinérgicamente con la del NO en diversas situaciones, como por
ejemplo contra la agregación plaquetaria. La secreción de PGI2 produce la activación
de la enzima adenilato ciclasa, con un aumento del AMPc, el cual actúa de manera
similar al GMPc (Boulanger y Vanhoutte, 1994). Además de esta sustancia
vasoactiva, el EDHF, induciría vasodilatación en vasos sanguíneos pequeños. Al
parecer el EDHF actuaría en el músculo liso por apertura de canales de K+,
independiente de ATP, que hiperpolarizaría el músculo liso, produciendo su
relajación. Esta vía también es dependiente de Ca2+ a nivel de célula endotelial, y
respondería a ACh en una respuesta mediada por receptores muscarínicos M1.
Sustancias como verapamilo, nifedipino o diltiazem producen un bloqueo de
los canales de Ca2+ de tipo L voltaje dependiente del músculo cardíaco y liso
vascular. Tanto el verapamilo como los otros bloqueadores del canal de Ca2+ inhiben
el flujo de entrada de Ca2+ con la consecuente vasorelajación (Flórez J, 2003).
Si bien existen otras sustancias vasodilatadoras como la insulina, el péptido
relacionado con el gen de la calcitonina, la adrenomedulina, anestésicos volátiles,
inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y el ion magnesio o, bien,
situaciones fisiopatológicas como hipoxia (Karaki y cols, 1997), son estímulos que
relajan el músculo liso pero que no guardan relación directa con el tema de esta
tesis.
Flavonoides y antocianinas en general, propiedades terapéuticas.
Los flavonoides pertenecen a un grupo de sustancias naturales con
estructuras polifenólicas variables que son encontradas en frutas, vegetales, granos,
corteza, raíces, vástagos, flores, té, y en el vino. Representan componentes
sustanciales de la parte no energética de la dieta humana (Aherne y cols, 2002).
7
Los flavonoides (Figura 2) son compuestos hidrosolubles de bajo peso
molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6),
compuesto por dos anillos de fenilos designados como A y B ligados a través de un
anillo heterocíclico de pirano, designado C (Kühnau, 1976). Esta estructura básica
permite una multitud de patrones de sustitución y variaciones en el anillo C. En
función de sus características estructurales, los grupos principales corresponden a
los flavanoles, flavonoles, flavonas y las antocianidinas, siendo esta última de
especial interés para nuestro estudio.
Las antocianinas (del griego anthos=flor y kianos= azul) representan una
parte importante tanto cuantitativa como cualitativamente de los flavonoides. Su
estructura corresponde a la combinación de su aglicón (antocianidina) y de un
azúcar (generalmente glucosa). Las antocianidinas del género Vitis son la cianidina,
la peonidina, la petunidina, la delfinidina y la malvidina. En las variedades de Vitis
vinifera, el azúcar se fija en posición 3 (Figura 3).
El vino tiene un alto contenido en compuestos polifenólicos, aproximadamente
se conocen unos 500, entre ellos los flavonoides, la mayoría de los cuales provienen
de la uva y del proceso fermentativo. En la uva estas moléculas se localizan en la
piel, especialmente en las células epidérmicas, y en las pepas. Su cantidad y tipo
depende principalmente de la variedad de la vid, del clima, del terreno y de las
prácticas de cultivo (Infante, 1997). Los extractos secos de hoja y hollejo de Vitis
vinifera son particularmente ricos en antocianidinas y en su forma glicosilada, y en
proantocianidinas (polímeros de antocianidinas).
El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia
actividad farmacológica. Pueden unirse a estructuras biológicas, tales como
enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; catalizar el transporte de electrones,
depurar radicales libres y quelar iones metálicos de elementos de transición, tales
como Fe2+, Cu2+, Zn2+, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. Debido
a este hecho se han descrito efectos protectores en patologías tales como diabetes
mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones vírales, úlcera gástrica y duodenal, e
8
inflamaciones (Saskia y cols, 1998). Otras actividades que merecen ser destacadas
son sus acciones antivirales y antialérgicas (Vrijsen y cols, 1988), así como sus
propiedades antitrombótica y antiinflamatoria (Swies y cols, 1984; Gryglewki y cols,
1987; Alcázar y cols, 1988; Brasseur, 1989).
Los flavonoides han mostrado efectos vasodilatadores en aorta aislada de
ratas, y disminución de las lesiones de isquemia y reperfusión del miocardio (Benito
y cols, 2002; Merck, 2000). Además, evitan el daño producido al endotelio vascular
al prevenir la sobrerregulación de mediadores inflamatorios (IL-8, MCP-1 y ICAM-1)
a través de la citoquina proinflamatoria TNF-α (Wang y cols, 2002; Youdim y cols,
2002).
Farmacología de los flavonoides y antocianinas en particular
Farmacocinética
Se ha estimado que dos tercios de la ingesta total de polifenoles de la dieta
humana corresponde a flavonoides, siendo los más abundantes las catequinas, las
proantocianidinas y las antocianidinas (Scalbert, 2000). Información acerca de la
absorción, distribución, metabolismo y excreción de los flavonoides individuales en
humanos es escasa e incluso contradictoria (Hollman y cols, 1996; Hollman y cols,
1997; Manach y cols, 1997; Hollman y cols, 1999). Además, la mayoría de los
estudios han sido diseñados usando flavonoides en su forma aglicona en vez de su
forma glicosilada, la que predomina en plantas (Dell’Agli y cols, 2004).
En lo que respecta a las antocianidinas, numerosos estudios han confirmando
que son absorbidas en su forma glicosilada luego del consumo oral (Cao y cols,
1999;
Tsuda,
1999;
Matsumoto
y
cols,
2001;
McGhie
y
cols,
2003;
Nielsen y cols, 2003). Todos los estudios realizados en animales y humanos
concuerdan que la biodisponibilidad de antocianidinas es baja (Morazzoni, 1991;
Lapidot y cols, 1998; Bub y cols, 2001; Passamionti y cols, 2003). A pesar de esta
baja biodisponibilidad absoluta (aproximadamente menor al 5%) y de una modesta
absorción gastrointestinal, un estudio de antocianinas de Vaccinium myrtilus mostró
alcanzar niveles plasmáticos de 2-3 µg/mL luego de un tratamiento oral con
9
400 mg/kg, lo que está en el rango de la actividad biológica reportada para estas
sustancias (Morazzoni y cols, 1991). Se ha reportado que las antocianidinas se
absorben en su forma glicosilada intacta (Dell’ Agli y cols, 2004), siendo esta forma
la de mayor absorción.
Efectos farmacológicos en la actividad endotelial vascular y vasomotora de
músculo liso
Dentro de los múltiples efectos farmacológicos de los flavonoides, se ha
reportado la modulación del tono vascular. Fitzpatrick y cols. (1993) demostraron
que el vino tinto y compuestos extraídos de la uva tales como la quercetina y el
ácido tánico, causan relajación endotelio dependiente en la aorta torácica de rata.
Después de este estudio, han habido múltiples estudios de las acciones
farmacológicas de los flavonoides en el tono del músculo liso vascular (Duarte y
cols, 1993; Chen y cols, 1996; Herrera y cols, 1996; Cishek y cols, 1997) e intestinal
(Di Carlo y cols, 1993; Hammad y cols, 1997). A pesar de haber transcurrido más de
una década desde ese entonces, aún no se ha logrado dilucidar el modo de acción
de los flavonoides.
Numerosos autores señalan que los compuestos polifenólicos del vino tinto
pueden inducir una relajación básicamente dependiente del endotelio de anillos
aórticos aislados de ratas, probablemente vía liberación de NO o por aumento de la
actividad biológica del NO, conduciendo a una acumulación elevada GMPc
(Fitzpatrick y cols., 1993; Andriambeloson y cols, 1998). Otros autores (Duarte y
cols, 1993; Herrera y cols, 1996; Flesch, 1998) han reportado vasorelajación
independiente de endotelio por parte de los flavonoides. Así, se ha observado para
la quercetina, cuando su respuesta fue examinada en aortas torácicas de ratas, una
relajación dependiente de endotelio (Fitzpatrick y cols. 1993 y por Chean and PacaAsicak, 1996), mientras otros reportaron relajación independiente de endotelio
(Duarte y cols, 1993; Herrera y cols, 1996; Flesch, 1998). Quizás estos diversos
resultados nos pueden sugerir que la quercitina, y probablemente otros flavonoides,
poseen ambas características vasorelajantes, dependientes e independientes de
endotelio, que deben ser clarificadas (Chan y cols, 2000).
10
Por otro lado, los efectos relajadores de ciertos compuestos de los diferentes
subgrupos estructurales de los flavonoides, siguen el siguiente orden de potencia
para la relajación: flavonoles>flavonas>flavanoles (Duarte y cols, 1993; Herrera y
cols, 1996) (Figura 4). Sin embargo, en otro estudio (Chan y cols, 2000), se reportó
igual potencia vasorrelajadora entre flavonas y flavonoles, excepto para 3’,3’,4’trihidroxiflavona.
Si bien los mecanismos por los cuales los compuestos polifenólicos producen
sus efectos vasorrelajadores siguen siendo desconocidos, diversos estudios han
sugerido su modo de acción. Se ha demostrado que la relajación dependiente de
endotelio inducida por compuestos polifenólicos del vino tinto sobre la aorta torácica
de ratas es mediado por un aumento del contenido de NO como resultado de un
aumento de la síntesis de NO más que a un efecto protector del NO a la oxidación
(Andriambeloson y cols, 1997). Con respecto al rol del Ca2+, se ha divulgado que la
relajación dependiente de endotelio vía NO inducida por los compuestos
polifenólicos es producida a través de un mecanismo Ca2+-dependiente extracelular
(Andriambeloson y cols., 1999).
La estructura de los flavonoides responsable de la actividad vasorrelajadora
de los vinos sigue necesitando de identificación. De hecho es muy escasa la
información disponible con respecto a la identidad de los compuestos responsables
de esta respuesta (Fitzpatrick y cols, 2000). Leucacianidol (flavan-3,4-ol) produce
efectos vasorrelajadora dependiente de endotelio y aumenta la producción de NO en
aorta de rata, mientras que la catequina, un compuesto cercanamente relacionado,
no presenta tal efecto (Andriambeloson y cols, 1997). La epicatequina-3-0-galato
aislada de las semillas de uva, reportó tener una baja actividad de vasorrelajación
dependiente de endotelio (Fitzpatrick y cols, 1997), pero otros compuestos no
identificados del tipo de las catequinas, incluyendo las proantocianidinas, parecen
ser considerablemente más activos. Así, es difícil predecir a priori en base a la
estructura química de los polifenoles que componen un extracto, si éste poseerá
11
propiedades vasorrelajadoras o no y, si vasorrelaja, tampoco es posible aventurar si
será dependiente, independiente de endotelio, o ambos.
Se ha reportado que las antocianinas de extractos enriquecidos en estos
compuestos producen vasorrelajación dependiente de endotelio, en forma más
potente
que
las
producidas
por
los
taninos
oligoméricos
condensados
(Andriambeloson, 1998). Ciertos flavonoides químicamente puros como la
delfinidina, pero no la malvidina ni cianidina, producen relajación dependiente de
endotelio (Andriambeloson, 1998). El efecto de la delfinidina está completamente
mediado por la vía NO. El nulo efecto sobre la relajación dependiente de endotelio
mostrado por la malvidina, está en acuerdo con los resultados previamente
reportados por Fitzpatrick y cols. (1993). Los tres flavonoides ensayados difieren en
su estructura por el número y estado de metoxilación de los sustituyentes hidroxilos.
Es así que entre las antocianinas, sólo algunas con estructura específica son
capaces de causar vasorrelajación dependiente de endotelio (Martin y cols, 2003).
12
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto del extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet
Sauvignon estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido, en la función vasomotora
de anillos aórticos de ratas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Determinar el efecto del EVvA sobre la respuesta contráctil de AA de ratas.
•
De observarse relajación, determinar si es dependiente o independiente de la
presencia de endotelio.
•
Determinar si los efectos observados con EVvA son concentración
dependiente.
•
Sugerir un mecanismo de acción que intente explicar el efecto del EVvA sobre
los AA.
13
HIPÓTESIS
H11: El extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido, produce vasorrelajación en
anillos aórticos de rata.
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido, no produce vasorrelajación en
anillos aórticos de rata.
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido, produce relajación dependiente
de endotelio en los anillos aórticos de rata.
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido, produce relajación independiente
de endotelio en los anillos aórticos de rata.
H31: Los efectos del extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido sobre los anillos aórticos
dependen de la concentración del extracto usado.
H30 : Los efectos del extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon
estandarizado al 0,02% de malvidin-3-glicósido sobre los anillos aórticos no
dependen de la concentración del extracto usado.
14
MATERIALES Y METODOS
MÉTODO
Población de estudio: Anillos aórticos de ratas. N=48
Tipo de estudio: Explicativo.
Diseño de investigación: Experimental in vitro.
Variables
•
Variable independiente: Extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet
Sauvignon estandarizado al 0,02 % de malvidin-3-glicósido.
•
Definición conceptual: EVvA producido y estandarizado por el Laboratorio
de Productos Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.
•
Definición operacional: concentración de EVvA, referido a concentración de
malvidin-3-glicósido, a la cual se observan cambios en la magnitud de la
respuesta contráctil del músculo liso de anillos aórticos.
•
Variable dependiente: cambio en la actividad vasomotora de los anillos
aórticos de rata.
•
Definición conceptual: capacidad de contracción o de relajación del músculo
liso vascular aórtico.
•
Definición operacional: porcentaje de cambio en la respuesta contráctil o de
relajación con respecto a la contracción control inducida por FE (1µM) o
solución despolarizante (70mM K+).
•
Variables desconcertantes:
o Estado de las ratas previo al ensayo experimental.
o Variación interindividual e intraindividual del operador en la aplicación
del protocolo experimental.
15
Criterios de inclusión/exclusión.
Inclusión:
•
Endotelio funcional en los anillos aórticos, determinado por una relajación
inducida por ACh (2,5x10-7 M) igual o superior al 50% de la contracción
inducida por FE (1µM) o solución despolarizante (70mM K+).
•
En ensayos endotelio independientes, la relajación de anillos aórticos
inducida por ACh (2,5x10-7 M) menor al 10% de la contracción inducida por
FE (1µM) o solución despolarizante (70mM K+).
•
En ensayos endotelio independientes, la relajación de anillos aórticos
inducida por Verapamilo (1x10-6 M) mayor al 50% de la contracción inducida
por solución despolarizante (70mM K+) o Ca+2 (3×10-3 M).
Exclusión:
•
Los anillos aórticos que no cumplan con los criterios de inclusión.
•
Los registros poligráficos de anillos aórticos contraídos con FE (1µM) o
solución despolarizante (70 mM K+) que exhiban una decusación positiva
equivalente a un desarrollo de tensión máxima estable menor de 500 mg.
Diseño Experimental
Cada rata fue asignada aleatoriamente a cada uno de los grupos
experimentales. Los anillos aórticos que cumplieron con los criterios de inclusión,
fueron tratados in vitro como se detalla a continuación:
•
Relajación endotelio dependiente
Grupo Control: Estabilización, FE (1µM), ACh (2,5x10-7 M), KHm (25 min), FE (1µM),
KHm (10 alícuotas de 100 µL) cada 2 min, ACh (2,5x10-7 M), KHm. (N=6).
Grupo Tratamiento Estabilización, FE (1µM), ACh (2,5x10-7 M), KHm (25 min),
FE (1µM), EVvA (0,1 a 1000 ng/mL) cada 2 min, ACh (2,5x10-7 M), KHm. (N=6).
16
•
Relajación endotelio independiente
Grupo Control: Estabilización, FE (1µM), ACh (2,5x10-7 M), KHm (25 min), FE (1µM),
KHm (10 alícuotas de 100 µL) cada 2 min, ACh (2,5x10-7 M), KHm. (N=5).
Grupo Tratamiento: Estabilización, FE (1µM), ACh (2,5x10-7 M), KHm (25 min),
FE (1µM), EVvA (0,1 a 1000 ng/mL) cada 2 minutos, ACh (2,5x10-7 M), KHm.
(N=12).
•
Relajación endotelio independiente en aortas precontraídas con solución
despolarizante
Grupo Control: Estabilización, solución despolarizante (70mM K+), solución
despolarizante (70mM K+) (10 alícuotas de 100 µL) cada 2 min, KHm, solución
despolarizante (70mM K+), verapamilo (1x10-6 M), KHm, solución despolarizante
(70mM K+), ACh (2,5x10-7 M), KHm. (N=5).
Grupo Tratamiento: Estabilización, solución despolarizante (70mM K+), EVvA (0,1 a
1000 ng/mL)
cada
2
minutos,
KHm,
solución
despolarizante
(70mM
K+),
verapamilo (1x10-6 M), KHm, solución despolarizante (70mM K+), ACh (2,5x10-7 M),
KHm. (N=6).
•
Contracción inducida por Ca2+
Grupo Tratamiento: Estabilización en KHm sin Ca
K+) sin Ca2+, Ca2+ (3×10-3 M), KHm sin Ca
2+
Ca2+,
cada
Ca2+
(1×10-5
a
3×10-3
M)
2+
, solución despolarizante (70mM
, solución despolarizante (70mM K+) sin
2
minutos,
KHm
sin
Ca2+,
EVvA (500 ng/mL, 15 min), solución despolarizante (70mM K+) sin Ca2+,
EVvA (500 ng/mL), Ca2+ (1×10-5 a 3×10-3 M) cada 2 minutos, verapamilo (1x10-6 M),
KHm sin Ca2+, solución despolarizante (70mM K+) sin Ca2+, Ca2+ (3×10-3 M),
ACh (2,5x10-7 M), KHm sin Ca2+. (N=8).
17
MATERIALES
Recurso físico
Los experimentos fueron realizados utilizando la infraestructura instalada del
laboratorio de Farmacodinamia y Fitofarmacología, Programa de Farmacología
Molecular y Clínica, ICBM, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile,
considerando además los animales, equipos y reactivos.
Animales
Se utilizaron ratas machos Sprague-Dawley, de 300 a 420 g de peso,
obtenidas del Bioterio Central de la Facultad de Medicina, mantenidas de acuerdo a
las normas internacionales dadas por el National Institute of Health (publicación
85-23, revisión 1985) con agua y alimento (Champion Nutricion Animal, Santiago,
Chile) proporcionados ad libitum.
Reactivos, soluciones y fármacos
NaCl, KCl, KH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, EDTA, glucosa, ACh,
L-fenilefrina (Sigma-Aldrich, MO, EEUU), isofluorano (Zeneca, Inglaterra), Extracto
de Vitis vinifera variedad Cabernet Sauvignon estandarizado al 0,02% de
malvidin-3-glicósido,
Equipos e Instrumentos
Polígrafos Grass modelos 79 D y 5D, cuatro transductores de fuerza Grass
modelo FT-03, PH-metro Oalton, Acorn series (Singapur), balanza analítica
Sartorius, pipetas automáticas 100µL y 1000µL, baño termorregulado Lauda
Termo-Temp, con regulación de 0º a 100ºC ± 0,5 ºC, cuatro baños de vidrio de doble
pared con entrada y salida de agua de recirculación, jeringas de vidrio de 10 mL,
material de vidrio (matraces, probetas, vasos de precipitado, pipetas volumétricas de
10 mL), ocho ganchos de acero inoxidable, instrumental quirúrgico, papel de registro
polígráfico Grass, balón de CO2-bioxide (95% O2 y 5% CO2), agua destilada.
18
PROCEDIMIENTO
Obtención y preparación de anillos aórticos torácicos de rata.
Las ratas fueron sacrificadas con una sobredosis de isofluorano (Zeneca
Laboratories, Inglaterra). Mediante una incisión torácica media se les extrajo
rápidamente la aorta, para luego sumergirlas en solución Krebs-Henseleit modificada
cuya composición fue la siguiente (mM): NaCl 122; KCl 4,7; CaCl2 x 2H2O 2,0;
MgCl2 x 6 H2O 1,2; KH2PO4 1,2; NaHCO3 15,5; EDTA 0,021 y Glucosa 11,5. La
solución fue preparada en agua destilada y se ajusto su pH a 7,4 con HCl (10% v/v)
o NaOH (0,1 N). El tejido graso y conjuntivo circundante al segmento aórtico fue
cuidadosamente eliminado, teniendo especial atención en no dañar el músculo liso
vascular e intentando preservar en forma intacta su endotelio. En los experimentos
sin endotelio, éste fue mecánicamente removido por medio de frotación con la punta
de una pinza curva sobre un papel filtro humedecido con KHm. Del segmento
inmediatamente inferior del arco aórtico, se cortaron cuatro anillos de una longitud
aproximada de 2 a 3 mm. Dos ganchos de acero inoxidable, atados cada uno a un
hilo de seda de 15 cm de longitud, fueron introducidos a través del lúmen de cada
anillo aórtico para posteriormente llevarlos al interior de jeringas de vidrio llenos con
10 mL de KHm, los que a su vez fueron instalados dentro de un baño de
recirculación de doble pared de vidrio, termorregulados a 37,0ºC ± 0,5ºC (Lauda
Termo-Temp). Cada anillo aórtico fue fijado mediante el hilo de sus ganchos, uno al
fondo del baño y el otro a un transductor de fuerza Grass FT-03 conectado a un
polígrafo Grass (modelos 7D y 5D), para la determinación de la fuerza isométrica. La
solución KHm fue permanentemente burbujeada con CO2-bioxide (95% O2 y
5% CO2).
Los anillos aórticos fueron sometidos a una tensión basal de 1,5 g y se les
estabilizó en la solución KHm por un período de una hora, cambiando la solución
cada 15 minutos para evitar la acumulación de metabolitos.
19
Contracción con FE o solución despolarizante
Después del período de estabilización los anillos fueron contraídos con
FE (1 µM) o solución despolarizante (70mM K+) según correspondiera, hasta
alcanzar una contracción estable o de meseta, para luego relajarlos lavando el tejido
con un cambio de solución KHm. Este procedimiento de contracción-relajación se
repitió 3 a 4 veces hasta lograr una respuesta contráctil máxima estable, siempre
dejando un tiempo de recuperación de 20 minutos entre cada ciclo. Una vez
alcanzada la respuesta máxima estable, se realizó el protocolo de relajación.
Relajación endotelio dependiente con EVvA
Una vez alcanzada la meseta de contracción inducida por FE, a los anillos
aórticos se les agregaron alícuotas de 100µL de concentraciones crecientes de
EVvA (0,1; 0,5; 1; 10; 50; 100; 250; 500 y 1000 ng/mL referido a la concentración de
malvidin-3-glicósido) cada 2 minutos. Para comprobar la indemnidad del endotelio,
los anillos aórticos fueron contraídos con
FE (1µM) y relajados con
-7
ACh (2,5x10 M), antes y una vez terminado el protocolo de EVvA. Se consideró
que el endotelio era viable si se observaba una relajación inducida por ACh igual o
superior al 50% de la contracción inducida por FE (1µM). Finalizado el protocolo, se
lavaron los anillos aórticos con solución KHm, observando si alcanzaban el valor de
tensión basal.
Relajación endotelio independiente con EVvA en anillos precontraídos con FE
Una vez alcanzada la meseta de contracción inducida por FE, los anillos
aórticos fueron relajados con ACh (2,5x10-7 M), para comprobar que estuvieran
efectivamente denudados de endotelio y posteriormente lavados con solución KHm.
Se consideró que el endotelio fue removido si se observaba una relajación inducida
por ACh igual o menor al 10% de la contracción inducida por FE (1µM).
Posteriormente los anillos aórticos fueron nuevamente contraídos con FE (1µM) y se
les agregaron cada dos minutos alícuotas de 100µL con concentraciones crecientes
de EVvA (0,1; 0,5; 1; 10; 50; 100; 250; 500 y 1000 ng/mL referido a la concentración
de malvidin-3-glicósido). Finalizado el protocolo, los anillos fueron contraídos con
FE (1µM) y se agregó ACh (2,5x10-7 M) para comprobar la denudación de los anillos.
20
Relajación endotelio independiente con EVvA en anillos precontraidos con
solución despolarizante
A los anillos aórticos contraídos con una solución despolarizante (70mM K+)
se les agregaron cada 2 minutos alícuotas de 100µL con concentraciones crecientes
de EVvA (0,1; 0,5; 1; 10; 50; 100; 250; 500 y 1000 ng/mL referido a la concentración
de
malvidin-3-glicósido).
Posteriormente
fueron
contraídos
con
solución
despolarizante (70mM K+) y relajados con verapamilo (1x10-6 M) para comparar los
resultados obtenidos con EVvA. Para finalizar los anillos fueron contraídos con
solución despolarizante (70mM K+) y se agregó ACh (2,5x10-7 M). Se consideró que
el endotelio fue removido si se observaba una relajación inducida por ACh igual o
menor al 10% de la contracción inducida por la solución despolarizante.
Para determinar el efecto de EVvA en la respuesta contráctil inducida por
Ca2+ extracelular, se indujeron respuestas contráctiles por la aplicación exógena de
Ca2+ en presencia de EVvA en una solución de KHm-K+ sin Ca2+ en anillos aórticos
desprovistos de endotelio. De manera similar a los protocolos anteriores, los anillos
aórticos fueron sometidos a una tensión basal de 1,5 g, pero se les estabilizó en la
solución KHm sin Ca2+ por una hora, cambiando la solución cada 15 minutos para
evitar la acumulación de metabolitos. Después del período de estabilización los
anillos fueron contraídos con Ca2+ (3×10-3 M) en un medio de KHm-K+ y sin Ca2+,
hasta alcanzar una contracción estable. Posteriormente se realizó el protocolo de
contracción en un medio con KHm-K+ sin Ca2+, con concentraciones crecientes de
Ca2+ (1×10-5 a 3×10-3 M), registrándose la respuesta a Ca2+ (3×10-3 M), como el
100% de contracción. Posteriormente se incubaron por 15 minutos los anillos
aórticos en KHm sin Ca2+ con 500 ng/mL de EVvA, repitiéndose el protocolo de
contracción. Para comprobar que los anillos estuviesen efectivamente denudados
fueron contraídos con KHm-K+ sin Ca2+ y fueron relajados con ACh (2,5x10-7 M).
Para comprobar la viabilidad del músculo liso los anillos fueron relajados con
verapamilo (1x10-6 M).
21
En todos los ensayos, se aplicó corrección de volumen por el aumento del
volumen del baño por la acumulación de alícuotas. Los resultados fueron
convertidos a unidades de fuerza (mN), para lo cual el desplazamiento del registro
poligráfico (mm) se multiplicó por el factor 9,8x10-3. Para hacer equivalente el
desarrollo de tensión de los anillos de aorta de diferente tamaño, sus valores de
tensión absoluta desarrollada (mN) fueron estandarizados al peso seco (mg) de las
aortas.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados fueron expresados como el promedio de los porcentajes de
relajación ± la desviación estándar. Las diferencias estadísticas entre los grupos
experimentales, antes y después de cada procedimiento, fueron determinadas con la
prueba t de Student. La significancia se estableció en p<0,05.
22
RESULTADOS
Relajación endotelio dependiente
En anillos con endotelio precontraídos con FE (1 µM), el EVvA produjo una
relajación de forma concentración-dependiente (Figura 4). Esta relajación es
significativa para las tres últimas concentraciones utilizadas del extracto (250 ng/mL
a 1000 ng/mL de extracto referido a malvidin-3-glicósido), con respecto a su grupo
control (Tabla 1), observándose una respuesta máxima (Emax) de 70,76% ± 10,4%,
respecto de la contracción máxima inducida por FE (1µM), la que se alcanzó a la
concentración de 1000 ng/mL. En el grupo control no se observó efecto significativo
sobre el tono vascular.
Relajación endotelio independiente en anillos aórticos precontraídos con FE
El EVvA indujo una relajación de los anillos aórticos sin endotelio en una
forma concentración-dependiente (Figura 5) a partir de una concentración de
50 ng/mL (Tabla 2), con respecto al grupo control.
Se observó una relajación
máxima (Emax) de 85,08% ± 24,72 alcanzada a la concentración de 1000 ng/mL. El
comportamiento de relajación inducido por EVvA (0,1 a 1000 ng/ml) en anillos
aórticos con y sin endotelio, no mostraron ser diferentes uno del otro
(Figura 6, p > 0,05).
Relajación endotelio independiente en anillos aórticos precontraídos con
solución despolarizante
(70
En
anillos
mM
+
K ),
sin
el
endotelio,
EVvA
precontraídos
produjo
una
con
solución
relajación
en
despolarizante
una
forma
concentración-dependiente (Figura 7). La relajación es manifiesta a partir de
50 ng/mL, respecto al grupo control (Tabla 3, Figura 7), observándose una relajación
máxima (Emax) de 72,25% ± 6,01% una vez alcanzada la concentración de 1000
ng/mL. En el grupo control no se observó efecto significativo sobre el tono vascular.
El comportamiento de relajación inducido por EVvA (0,1 a 1000 ng/ml) en anillos
aórticos sin endotelio precontraidos con FE (1 µM) y los precontraídos con solución
23
despolarizante
(70mM
K+),
no
mostraron
ser
diferentes
uno
del
otro
(Figura 8, p>0,05).
En anillos sin endotelio, tras la aplicación exógena de Ca2+ (0,01mM a 3 mM)
en solución despolarizante (70 mM K+),
se obtuvo una curva de contracción,
alcanzando una contracción máxima de los anillos aórticos correspondiente al 100%
(control).
La
contracción
máxima
se
produjo
con
una
concentración
de
Ca2+ 3 mM (Figura 9).
Al repetir la curva de contracción inducida por Ca2+ en presencia de
500 ng/mL, se observó un desplazamiento no paralelo hacia la derecha de la curva
control, la cual no alcanzó el efecto máximo de la curva control (82,25 % ± 7,85 % a
Ca2+ 3 mM), post incubación.
24
DISCUSIÓN
Nuestros resultados muestran que el EVvA produce relajación de anillos
aórticos de rata con endotelio precontraídos con FE a concentraciones de 250 a
1000 ng/mL, de forma concentración-dependiente, alcanzando un efecto máximo de
70,76% ± 10,40% de relajación relativa a la contracción máxima inducida por FE, a
1000 ng/mL de EVvA. Por otro lado,
en anillos sin endotelio observamos una
relajación inducida por concentraciones de EVvA en el rango de 50–1000 ng/mL,
alcanzando un efecto máximo de 85,08% ± 24,72%. La relajación inducida por EVvA
en anillos aórticos con y sin endotelio no mostraron ser diferentes uno del otro, lo
que sugiere que el efecto vasorrelajador observado se produciría por un mecanismo
que no guarda relación con la presencia del endotelio vascular. La vasorrelajación
inducida por polifenoles del vino tinto ha sido bien documentada (Fitzpatrick y
cols,1993; Andriambeloson y cols, 1997; Andriambeloson y cols, 1998; Flesch y
cols, 1998; Andriambeloson y cols, 1999). La magnitud de la relajación obtenida y el
rol jugado por el endotelio varían entre las sustancias que han sido estudiadas. Si
bien los compuestos polifenólicos obtenidos de extractos de vino tinto muestran una
relajación relativa del músculo liso vascular dependiente de endotelio a través de la
liberación de óxido nítrico, nuestros resultados no deberían sorprender dado que se
han reportado respuestas vasorrelajadores tanto dependientes como independientes
de endotelio tras el tratamiento con numerosos flavonoides.
Se ha sugerido que las acciones vasorrelajadoras de los flavonoides
dependerían de su estructura química. Se ha reportado que la presencia de un
sustituyente hidroxilo en la posición C6 y la presencia de tres sustituyentes hidroxilos
contiguos reducen la actividad vasorrelajadora de los flavonoides (Ajay y cols, 2003).
Podríamos suponer que las antocianinas estarían estructuralmente favorecidas para
inducir vasorrelajación. La magnitud de vasorrelajación cambia en función de la
variabilidad de los componentes del vino tinto de acuerdo a las variedades de uva, al
área de cultivo, y los métodos de vinificación. Así resulta muy difícil predecir a priori
en base a los componentes de un extracto cual sería su comportamiento.
Andriambeloson (Andriambeloson y cols, 1998) estudió en forma de extracto y
25
comparó sus resultados con aquellos producidos por los compuestos puros por si
solos, entre ellos la malvidina. La malvidina pura produjo una relajación
independiente de endotelio, de modo semejante a lo observado en nuestros
resultados con EVvA, aunque en menor magnitud, por lo que podríamos presumir
que los otros compuestos contenidos en EVvA contribuyan al efecto vasorelajador
neto observado.
Al comparar los resultados del EVvA en anillos aórticos contraídos con FE y
solución despolarizante, hemos constatado que las respuestas vasorrelajadoras no
presentan diferencias estadísticamente significativas entre ellas, o sea, las
contracciones de los anillos aórticos inducidas por dos agentes distintos responden
de similar manera a la acción de EVvA, ante la presencia del agente vasoconstrictor.
Este hecho resulta interesante ya que puede orientar la búsqueda del mecanismo de
vasorrelajación de EVvA. En este sentido, parece lógico buscar una vía de acción
común para ambos agentes que se vea alterada por el EVvA. La FE produce la
contracción de los anillos aórticos al unirse a sus receptores α adrenérgicos
ubicados en el lado extracelular de la membrana plasmática. Estos receptores están
acoplados a proteína G heterotrimérica, que estimula la actividad de la fosfolipasa C
para producir dos clases de segundos mensajeros: (1) el IP3, que uniéndose a sus
receptores del retículo sarcoplásmico produce finalmente la liberación de Ca2+ hacia
el citoplasma; (2) el DG, que junto con Ca2+ activa la proteina kinasa C, la cual
promueve la contracción al fosforilar los canales de Ca2+ de tipo L (Webb, 2003). El
efecto final es un cambio en el potencial transmembrana que permite la apertura de
los canales de Ca2+ tipo L voltaje dependiente, permitiendo la entrada de Ca2+
extracelular hacia el citoplasma y desencadenando la contracción sostenida del
músculo liso. A diferencia de la FE, las soluciones con alto contenido en iones, como
el K+, producen la contracción del músculo liso por despolarización directa de los
canales de Ca2+ tipo L voltaje dependiente, permitiendo el flujo de entrada de Ca2+
sin necesidad de recurrir a segundos mensajeros intracelulares.
Estos mecanismos de contracción tienen en común la activación de los
canales de Ca2+ tipo L voltaje dependiente que posibilita la entrada de Ca2+ al
26
músculo liso, evento que sugerimos como el posible nivel de acción del EVvA dado
los similares efectos vasorrelajadores mostrados por éste ante FE y solución
despolarizante alta en K+. El EVvA posiblemente interactuaría con la célula muscular
en su periferia. Pensamos que el sitio de unión del EVvA estaría ubicado en la
membrana plasmática de la célula muscular, en su lado extracelular. Los resultados
de Kuresh y cols (2000) brindan sustento a nuestro supuesto ya que mostraron que
en células endoteliales aórticas incubadas por 4 horas en un extracto de elderberry,
la incorporación de antocianinas que tenían una estructura molecular glicosilada se
produjo principalmente por fijación a nivel de la membrana plasmática de la célula
endotelial.
Para intentar dilucidar algo más del mecanismo por el cual el EVvA produce
su efecto vasorrelajador, diseñamos un modelo experimental de competencia entre
el EVvA y Ca2+. La figura 9 muestra dos curvas de contracción por Ca2+ en anillos
aórticos antes y después de un período de 15 minutos de incubación con 500 ng/ml
de EVvA. Se puede observar que la respuesta contráctil a Ca2+ después del periodo
de incubación con EVvA es significativamente menor. Esto nos sugiere que de
alguna forma el EVvA interfiere la respuesta contráctil inducida por Ca2+ de los
anillos aórticos. El modelo experimental nos asegura la despolarización de la
membrana plasmática del músculo liso, y la apertura de los canales de Ca2+ tipo L
voltaje dependiente que permiten la entrada de Ca2+ hacia el citoplasma,
produciéndose el efecto vasoconstrictor. De esta forma, parece probable que la
interferencia, por parte del EVvA, del mecanismo que permite el flujo de entrada de
Ca2+ explique la disminución de la contracción de los anillos aórticos observada. El
canal de Ca2+ tipo L voltaje dependiente aparece como un sitio posible de
interacción entre el EVvA y la membrana plasmática del músculo liso. Chan y cols.
(2000) obtuvieron resultados similares a los nuestros, al comprobar que los
flavonoides apigenina, luteolina, crisina, fisetina, quercetina y 3,3`,4`-trihidroxiflavona
inhibieron la contracción de anillos aórticos producida por flujo de entrada de Ca2+.
Se sugiere que estos flavonoides podrían inhibir el flujo de entrada de Ca2+ a través
de los canales de Ca2+ tipo L voltaje dependiente (Ko y cols, 1991; Chan y cols,
2000).
27
El análisis de la forma de las curvas de contracción inducida por Ca2+ de los
anillos aórticos nos sugiere una interacción antagónica entre el EVvA y el Ca2+
(Figura
9).
Ambas
curvas
concentración-efecto
comienzan
a
una
misma
concentración de Ca2+ (0,01 mM), exhibiendo un desplazamiento hacia la derecha
de la curva de contracción inducida por Ca2+ en presencia de EVvA (500 ng/mL)
para las concentraciones de Ca2+ que resultan significativamente diferentes (0,3 mM
a 3 mM) sin alcanzar la contracción máxima pre incubación. Si bien la evidencia es
preliminar, aparentemente se trataría de un antagonismo de tipo no competitivo o de
tipo funcional. Esto implicaría una interacción del EVvA con el canal de Ca2+ tipo L
voltaje dependiente.
En resumen, el EVvA ejerce un efecto vasorrelajador en los anillos aórticos
precontraídos con FE (1µM) y K+ (70mM), Este efecto es independiente de la
presencia de endotelio y se explicaría probablemente por una disminución en el flujo
de entrada de Ca2+ hacia la célula muscular, en una interacción farmacodinámica
antagonista no competitivo o funcional con el canal de Ca2+ tipo L voltaje
dependiente.
28
CONCLUSIONES
•
El extracto de Vitis vinifera, variedad Caberbet Sauvignon estandarizado al
0,02% de malvidín-3-triglicósido produce vasorrelajación independiente de
endotelio en anillos aórticos de rata precontraídos con FE (1µM) o solución
despolarizante (70mM K+), por lo que se aprueba la hipótesis H11 y H20.
•
La relajación endotelio independiente tiene un comportamiento dependiente
de la concentración, por lo que se aprueba la hipótesis H31.
•
Proponemos como mecanismo de acción putativo a la vasorrelajación
independiente de endotelio, un antagonismo al flujo de entrada de Ca2+ desde
el espacio extracelular.
29
PROYECCIONES
A partir de los resultados obtenidos en nuestro estudio, podemos establecer
que el EVvA es un efectivo agente vasorrelajador, en anillos aórticos de rata. Esta
propiedad es independiente de la presencia de endotelio vascular, lo que podría
potenciar aún más sus potenciales aplicaciones farmacológicas. Si bien es necesario
una serie de estudios in vivo en animales y estudios clínicos en seres humanos de
tipo farmacocinético y farmacodinámico, estos resultados preliminares son recién un
primer paso que nos podría ayudar a orientar su uso como un posible fitofármaco
vasorrelajador en todas aquellas patologías que cursan con pérdida o déficit de esta
propiedad vascular, por un daño en su función endotelial. Para ello consideramos
necesario a corto plazo su estudio, por ejemplo, en modelos in vitro de hiperglicemia
aguda in vivo en ratas diabéticas, para observar su posible efecto en la reversión de
la disfunción endotelial inducida por especies reactivas de oxígeno en estos modelos
funcionales.
Las antocianinas presentan ventajas comparativas en relación a las
proantocianinas, tales como sus costos de producción y extracción, lo que las hace
más interesantes para su posible desarrollo fitofarmacológico posterior.
Pensamos que son necesario estudios futuros a corto plazo para dilucidar
aspectos
farmacocinéticos
del
EVvA
como
su
capacidad
de
absorción,
biodisponibilidad, metabolización, eliminación y toxicidad; y farmacodinámicos, como
el nuestro, con el fin de conocer a cabalidad todas sus propiedades farmacológicas.
Este tipo de estudio contribuye a aumentar el conocimiento general sobre los
fitofármacos. El uso de fitomedicamentos ha aumentado en los últimos años, y el
profesional de la salud, como agente consultor para la población general, debe
conocer sus propiedades y aplicaciones; por lo tanto, la investigación en esta área
puede y debe ser desarrollada por agentes de salud, incluyendo a los kinesiólogos.
30
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36
ANEXO
Figura 1. Esquema movimientos Ca2+ en el músculo liso.
37
Figura 2. Esqueleto general básico de un flavonoide.
R1
R2
Antocianina
H
H
Pelargonidin
OH
H
Cianidin
OH
OH
Delfinidin
OCH3
H
Peonidin
OCH3
OH
Petunidin
OCH3
OCH3
Malvidin
Figura 3. Esqueleto general de una antocianina y sus variedades
38
Figura 4. Esqueleto general de flavonol, flavona y flavanol
39
[EVvA] en el baño de
órgano
Concentración - log [EVvA]
(ng/mL)
(g/mL)
0,1
10
0,5
9,3
1
9
5
8,3
10
8
50
7,3
100
7
250
6,6
500
6,3
1000
6
Relajación Relativa (%)
Control
Tratamiento
1,18 ± 1,84
3,9 ± 4,52
4,38 ± 4,89
5,33 ± 6,24
4,77 ± 5,84
5,38 ± 6,35
5,38 ± 6,35
5,95 ± 6,65
5,95 ± 6,65
5,95 ± 6,65
0,64 ± 1,48
1,21 ± 2,02
2,02 ± 2,37
1,14 ± 3,5
1,42 ± 3,78
4,56 ±7,39
9,59 ± 7,97
16,72 ± 8,75*
30,90 ± 13,16**
70,76 ± 10,40***
Tabla 1. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos con
endotelio precontraídos con FE. Los valores fueron expresados como el promedio
de la relajación relativa ± su desviación estándar. *P<0,05; **P<0,01; ***P< 0,001
indican las diferencias significativas entre el grupo de tratamiento (n=6) y su control
(n=6).
40
Figura 5. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos con
endotelio precontraídos con FE. Curvas concentración-respuesta a EVvA
(■; n=6) y a control (□; n=6) en anillos aórticos precontraídas con FE (1µM).
Todos los valores son expresados como el promedio los porcentajes de relajación
en relación a la contracción inicial ± su desviación estándar. *P<0,01; **P<0,05;
***P<0,001.
41
[EVvA] en el baño de órgano
(ng/mL)
(g/mL)
0,1
10
0,5
9,3
1
9
5
8,3
10
8
50
7,3
100
7
250
6,6
500
6,3
1000
6
Control
Tratamiento
0,48 ±1,07
0,86 ± 1,19
1,20 ± 1,37
1,00 ± 1,63
0,78 ± 1,92
1,08 ± 3,01
2,86 ± 3,09
1,72 ±2,68
1,30 ± 3,85
1,48 ± 3,82
0,29 ± 0,58
0,39 ±0,39
1,60 ± 0,80
0,90 ± 1,21
2,01 ± 1,88
4,86 ± 2,70*
11,77 ± 8,35*
22,26 ± 12,50 **
48,20 ± 20,70***
85,08 ± 24,72***
Tabla 2. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos sin endotelio
precontraídos con FE. Los valores fueron expresados como el promedio de la
relajación relativa ± su desviación estándar. *P<0,05; **P< 0,01; ***P< 0,001 indican
las diferencias significativas entre el grupo de tratamiento (n=12) y su control (n=5).
42
Figura 6. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos sin
endotelio precontraídos con FE. Curvas concentración-respuesta a EVvA
(▲; n=12) y a control (□; n=5) en anillos aórticos precontraídos con FE (1µM).
Todos los valores son expresados como el promedio los porcentajes de relajación
en relación a la contracción inicial ± su desviación estándar. *P<0,01; **P<0,05;
***P<0,001.
43
Figura 7. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos con y sin
endotelio precontraídos con FE. Curvas concentración-respuesta a EVvA en
anillos aórticos con endotelio (■; n=6) y sin endotelio (▲; n=12), precontraídos con
FE (1µM). Todos los valores son expresados como el promedio de los porcentajes
de relajación con respecto a la contracción inicial, ± su desviación estándar. No se
observa diferencia significativa en ninguno de los puntos de ambas curvas.
44
[EVvA] en el baño de órgano
(ng/mL)
(g/mL)
0,1
10
0,5
9,3
1
9
5
8,3
10
8
50
7,3
100
7
250
6,6
500
6,3
1000
6
Control
Tratamiento
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,51 ± 0,71
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,51 ± 0,71
1,50 ± 2,12
2,51 ± 0,69
1,52 ± 2,14
2,53 ± 3,57
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,16 ± 0,73
0,93 ± 1,93
4,85 ± 4,08*
10,81 ± 7,98*
26,53 ± 15,12**
47,25 ± 13,53***
72,25 ± 6,01***
Tabla 3. Relajación relativa inducida por EVvA en anillos aórticos sin
endotelio precontraídos con solución despolarizante. Los valores fueron
expresados como el promedio de la relajación relativa expresada en porcentaje con
respecto a la contracción inicial ± su desviación estándar. *P<0,05; **P<0,01;
***P<0,001 indican las diferencias signifcativas entre el tratamiento sin endotelio
(n=6) y su respectivo control (n=5).
45
endotelio precontraídos con solución despolarizante. Curvas concentraciónrespuesta a EVvA (♦; n=6) y a control (□; n=5) en anillos aórticos sin endotelio,
precontraídas con solución despolarizante (70mM K+). Todos los valores son
expresados como el promedio de los porcentajes de relajación en relación a la
contracción inicial ± su desviación estándar. *P<0,01; **P<0,05; ***P<0,001.
46
endotelio
precontraidas
con
FE
y
solución
despolarizante.
Curvas
concentración-respuesta a EVvA en anillos aórticos sin endotelio precontraídas con
FE (1µM) (▲; n=12) y solución despolarizante (70mM K+) (♦; n=6). Todos los
valores son expresados como el promedio de los porcentajes de relajación en
relación a la contracción inicial ± su desviación estándar mostrada en líneas
verticales. No se observa diferencia significativa en ninguno de los puntos de ambas
curvas.
47
[Ca2+] en el baño de órgano
Concentración - log [Ca2+]
(mM)
(M)
0,01
5
0,03
4,5
0,05
4,3
0,1
4
0,3
3,5
0,5
3,3
1
3
3
2,5
Contracción Relativa (%)
Pre incubación
Post incubación
3,41 ± 5,81
9,32 ± 5,82
16,53 ±7,86
30,19 ±14,66
49,88 ±14,28
71,82 ±8,71
86,82 ±4,64
100 ± 0,00
3,79 ±4,79
6,91± 7,75
10,97± 7,99
18,01± 10,39
34,00 ± 12,29*
49,34 ± 12,71**
65,38 ± 10,98***
80,25 ± 7,85 ***
Tabla 4. Contracción relativa inducida por Ca2+ en anillos aórticos sin
endotelio pre y post incubación con EVvA. Los valores fueron expresados como
el promedio de la contracción relativa ± su desviación estándar, tomando como
referencia la contracción máxima registrada en la concentración de Ca2+ 3 mM pre
incubación. *P<0,05; **P< 0,01; ***P<0,001 indican las diferencias significativas
entre el tratamiento preincubación (n=8) con respecto al tratamiento post incubación
(n=8).
48
Figura 10. Contracción relativa inducida por Ca2+ en anillos aórticos pre y post
incubación con EVvA. Curvas concentración-respuesta a Ca2+ en anillos aórticos
sin endotelio pre (○; n=8) y post (●; n=8) incubación con EVvA (500 ng/mL). Todos
los valores son expresados como el promedio de los porcentajes de contracción en
relación a la contracción máxima ± su desviación estándar. *P<0,05; **P< 0,01;
***P < 0,001 .
49