Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA

Instrucciones de Uso
Borrelia 14kDa + OspC
IgM ELISA
Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación
cualitativa o cuantitativa de anticuerpos IgM contra los 14 kDa y OspC
antígenos de Borrelia burgdorferi en suero humano, plasma y LCR.
Son detectadas las infecciones correspondientes a las tres subclases de
B. burgdorferi (garinii, afzelii y sensu strictu).
RE57211
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
1.
ESPAÑOL
USO PROPUESTO
Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación cualitativa o cuantitativa de
anticuerpos IgM contra los 14 kDa y OspC antígenos de Borrelia burgdorferi en suero humano, plasma y
LCR. Son detectadas las infecciones correspondientes a las tres subclases de B. burgdorferi (garinii, afzelii
y sensu strictu).
2.
IMPLICACIONES CLÍNICAS
Borrelia burgdorferi, es una bacteria del género Spirochaetaceae, es el agente etiológico de la enfermedad
de Lyme (Borreliosis), siendo la enfermedad mas común en Europa y los EE.UU, transmitidos por
garrapatas (Ixodes sp.) Lyme borreliosis es una enfermedad multi-sistémica con amplio espectro en los
síntomas clínicos. Un síntoma típico de la fase aguda es la Eritema crónico migratorio (ECM), a menudo
acompañado de síntomas semejantes a la gripe. En las etapas posteriores de la enfermedad pueden
manifestarse artritis, carditis, así como afecciones neurológicos y oftalmológicos. Lyme borreliosis puede
tratarse con antibióticos en todas la etapas. Por lo tanto la detección de la fase inicial de la enfermedad en
forma segura y sensible a través del diagnóstico de un laboratorio es de gran importancia, ya que un
tratamiento precoz es altamente apreciado.
Los anticuerpos IgM usualmente aparecen aproximadamente después de las tres semanas de infección, los
anticuerpos IgG después de cuatro o seis semanas, la pronta reacción immune se dirige principalmente
contra el péptido de la flagelina (41 kDa) y el OspC (superficie exterior de la proteína C, 23 kDa) y se
extiende más y más sobre proteínas bacterianas.
En este ensayo el fragmento de la flagelina 14 kDa de Borrelia burgforferi- especifica es utilizado como una
proteína recombinante para los anticuerpos vinculantes. Este recombinante fragmento de la flagelina,
producido en E. coli, resulta ser idéntico en las tres subespecies de Borrelia. Los resultados de extensos
estudios comparativos con ELISA, IFA y pruebas de aglutinación, así como Western Blot demuestran que
los 14 kDa IgM ELISA son de mayor especificidad diagnóstica, así como una alta sensibilidad diagnóstica
en el caso de una respuesta immune temprana en la enfermedad de Lyme. Además del recombinante
fragmento de la flagelina, se utiliza la proteína nativa OspC como recubrimiento de antígeno en la IBL
Borrelia 14 kDa + OspC ELISA IgM.
Usualmente los altos títulos de anticuerpos IgM indican una fase aguda de la infección. Los elevados títulos
de los anticuerpos IgG con o sin bajos títulos sobre anticuerpos IgM puede ocurrir cuando la borreliosis es
disminuida (debido a una terapia o espontáneamente) durante la fase crónica. La prueba de Borrelia IgM se
puede utilizar para el diagnóstico de la borreliosis de Lyme en la fase aguda y crónica de la enfermedad en
tanto requieren una terapia. Los pacientes con una disminución de Borreliosis que no require ningún
tratamiento, no muestran más resultados positivos.
3.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
Fase sólida del ensayo enzimático inmunológico (ELISA) basado en el principio de sandwich. Los pocillos
son revestidos con antígeno. Anticuerpos específicos de las muestras, que se encuentran unidos a los
antígenos del revestimiento de los pocillos, son detectados a través de una enzima secundaria conjugada
con un anticuerpo específico para IgM humana (E-Ab). Luego de que el substrato reacciona, la intensidad
del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgM detectados. Los resultados de las
muestras pueden ser determinados directamente a través de la curva estándar o el índice de corte.
4.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional.
2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida
del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo.
3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su
suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los
componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.
4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No
use reactivos vencidos.
5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio,
guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.
6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y
cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de
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Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o
mediante solicitud directa a IBL.
7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos
peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad.
8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos.
9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel.
10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y
encontrados negativos para anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. Sin embargo, la presencia de estos u
otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben
ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación.
5.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 °C. Manteniéndose
alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos
preparados se detalla en los capítulos correspondientes.
Una vez abierto el estuche, la placa de microtitración es estable hasta 3 meses en su envase roto, pero
herméticamente sellado, si se almacena a 2-8 °C .
6.
TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Suero, Plasma (EDTA)
Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad
química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras
fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse
antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado.
Almacenamiento Suero/Plasma/LCR:
2-8°C
Estabilidad Suero/Plasma/LCR:
5 dias
7.
≤ -20°C
(Alícuotas)
12 meses
Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa.
Evite congelar y descongelar repetidamente.
MATERIALES SUMINISTRADOS
Cantidad
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP IgM
1 x 12 mL
ENZCONJ IgM
1 x 4 x 1.5 mL
CAL A-D
Componente
Placa de Microtitulación
Tiras separables. Revestido con antígenos específicos.
Conjugado Enzimático
Listo para usar. Coloreado en rojo. Contenido: anti IgM humano, conjugado con
peroxidasa.
Estándar A-D
2; 10; 25; 100 U/mL
Standard B = Cut-off Standard
Listo para usar. Contenido: IgM anticuerpos contra B. burgdorferi, estabilizadores.
1 x 1.5 mL
CONTROL +
1 x 1.5 mL
CONTROL -
1 x 100 mL
DILBUF M
1 x 100 mL
1 x 15 mL
1 x 15 mL
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Control Positivo
Listo para usar. Contenido: IgM anticuerpos contra B. burgdorferi, estabilizadores.
Control Negativo
Listo para usar. Contenido: Suero humano, estabilizadores.
Solución Buffer de Dilución IgM
Listo para usar. Coloreado en azul. Contenido: Absorbente de FR (cabra anti IgG
humano).
Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x)
WASHBUF CONC Contenido: Solución buffer fosfatada.
Solución de Substrato TMB
TMB SUBS
Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores.
TMB STOP
Solución de Parada TMB
Listo para usar. 1 M H2SO4.
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MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 5; 10; 100; 1000 µL
(ajustable)
2. Vortex
3. Tubos (≥ 1 mL) para la dilución de las muestras.
4. Incubadora, 37 °C
5. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo
6. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración
7. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de
referencia 600-650 nm)
8. Agua bidestilada o desionizada
9. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro
9.
INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO
1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede
alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas
de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo
pipetas u otros dispositivos calibrados.
2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que
los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que
todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) y agite suavemente por
rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.
3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva
para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén
en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.
4. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa.
5. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo
orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de
8 canales.
6. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados
conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático
de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las
placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al
enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado
y que no haya residuos en ellos.
7. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura
ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa
resellada con desecante.
10.
INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO
10.1. Preparación de componentes concentrados
Diluya /
Componente
disuelva
100 mL
WASHBUF
CONC
Diluyente Relación
agregue
1000 mL
agua
bidest.
1:10
Notas
Resolve los cristales
a 18-25°C.
Almacenamiento Estabilidad
2-8 °C
2 meses
10.2. Dilución de Muestras
10.2.1. Suero, Plasma
Muestra
Suero, Plasma
para ser diluído
con
Relación
Notas
generalmente
DILBUF
1:101
p.e. 10 µL + 1 mL
Las muestras que contengan concentraciones superiores al estándar más alto tienen que ser aún más diluidas.
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10.2.2. Suero/CSF
Para el diagnóstico de Líquido cefalorraquídeo (LCR), de acuerdo con Reiber, es necesario utilizar
aproximadamente concentraciones similares o de índices de corte (COI) en el rango de DO de 2.0 a 0.3
para el suero y el LCR. Para este fin, generalmente se realiza las siguientes diluciones.
Muestra
para ser diluído
con
Relación
Notas
Suero
generalmente
DILBUF
1:101
p.e. 10 µL + 1 mL
CSF
generalmente
DILBUF
1:4
50 µL + 150 µL
Los índices de corte son corregidos con los factores de dilución en relación a la dilución 1:101. El índice de
corte para la dilución de 1:401 en suero debe ser multiplicado por 4 y la dilución 1:4 LCR debe ser dividido
por 25.
Si los resultados de las muestras no se encuentran dentro del rango de DO 2.0 a 0.3, se deben realizar un
conjunto de diluciones. Las siguientes diluciones recomendadas son:
Suero
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
LCR
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
Las muestras para la prueba de IgM no deben ser tratados con RF-absorbente, debido a que
la RF-absorbente ya es parte del Buffer Diluyente.
El tiempo utilizado para la preparación de las muestras debe ser < 15-20 min.
11.
1.
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3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Pipetee 100 µL de cada Estándar, Control y muestra diluída en cada pocillo respectivo de la Placa
de Microtitulación. En la prueba cualitativa solo es usado el Estándar B (Estándar de Corte).
Incube 1h a 37 °C. Utilizar papel adhesivo o una cámara humeda.
Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µL de
Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la
placa invertida sobre una toalla de papel.
Pipetee 100 µL de Conjugado Enzimático en cada pocillo.
Incube 30 min a 37 °C. Utilizar papel adhesivo o una cámara humeda.
Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µL de
Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la
placa invertida sobre una toalla de papel.
Para la adición del sustrato y solución de parada utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La
adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la
formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen.
Pipetee 100 µL de Solución de Substrato TMB en cada pocillo.
Incube 30 min a TA en la oscuridad.
Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µL de Solución de Parada en cada pocillo.
Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa.
Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm)
dentro de los 60 min de haber agregado la Solución de Parada.
CONTROL DE CALIDAD
Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además
el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables.
Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de
acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben
encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este
criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras
conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la
calidad adecuados.
En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los
reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de
lavado.
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13.
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CÁLCULO DE RESULTADOS
La evaluación de la prueba se puede realizar ya sea cualitativamente o cuantitativamente.
13.1. Evaluación Cualitativa
El valor de corte está dado por la densidad óptica (DO) del Estándar B (nivel de corte). El Indice de Corte
(COI) se calcula a partir de la media de densidad óptica de la muestra y el valor de corte. Si la densidad
óptica de la muestra está dentro de un rango de 10 % de todo el valor de corte (Zona gris) la muestra tiene
que ser considerada como límite. Las muestras con mayor DOs son positivas, las muestras con menos DOs
son negativas.
Muestra tipica:
Índice de Corte: DO (Estándar B, Estándar de Corte) = 0.45
Muestra DO = 0.60
Ìndice de Corte (COl): 0.60/0.45 = 1.33 La muestra ha de ser considerada positiva.
13.2. Evaluación Cuantitativa
La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en
papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4
Parameter Logisticos or Logit-Log.
Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (en el caso de
desviaciones obvias, omita el duplicado y utilice el valor de la determinación individual mas plausible). La
concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar.
La dilución inicial se ha tenido en cuenta al leer los resultados de la gráfica. Resultados de las muestras de
mayor predilución debe ser multiplicados por el factor de dilución.
Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se
describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente.
Curva de Calibración Tipica
(Ejemplo. ¡No usar para el cálculo!)
Estándar
U/mL
A
2
B
10
C
25
D
100
(OD)
2.500
DOMedia
0.011
0.414
0.856
2.167
Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1
14.
10
100
(U/mL)
INTERPRETACION DE RESULTADOS / VALORES ESPERADOS
Método
Cuantitativa
(Curva de Calibración):
Cualitativa (Cut-off
Index, COI):
Intervalo
> 11 U/mL
9 – 11 U/mL
< 9 U/mL
> 1.1
0.9 – 1.1
< 0.9
Interpretación
positivo
intermedio
negativo
positivo
intermedio
negativo
Los resultados por si solos no
deben ser la única razón para
un tratamiento terapéutico,
sino que deben correlacionarse
con observaciones clínicas y
ensayos de diagnóstico.
El caso de resultados IgM negativos con un resultado negativo IgG, una brusellosis aguda es poco
probable. Pero una infección reciente no puede ser descartada si las muestras fueron tomadas antes de las
3 semanas desde la infección, ya que los anticuerpos se forman durante este período. Si la muestra resulta
IgG positiva o en límite indica un infecciones crónica o tardías, debido a la estimulación policlónica
causadas por otras infecciones. Una estimulación policlónica puede excluirse mediante el análisis de
Western Blot. Los resultados deben ser confirmados por un sequimiento de control después de 14 días.
Resultados IgM límite acompañado con un resultado negativo IgG puede ocurrir en infecciones agudas y
ser confirmadas por un seguimiento de control después de 14 días (títulos constantes o incrementados) o
por análisis de Western Blot. Si el resultado de IgG son positivos o límites, este resultado es indicativo de la
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persistencia de una infección aguda que requiere tratamiento. Sin embargo la estimulación policlonal debe
excluir a la anterior.
Resultados IgM positivos que coinciden con los resultados negativos de IgG son indicativos de una
primera fase de la infección aguda. Resultados de IgM positivos o en límite de IgG son indicativos de una
infección aguda persistente. La Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA presenta una elevada sensibilidad y
especificidad para la detección precoz de la respuesta immune a la infección por Borrelia burgdorferi
debido al uso de antígenos recombinantes del fragmento de 14 kDa Borrelia flagellin y el purificado OspC
nativas a la que la primera respuesta immune se dirige principalmente. Con esta prueba se reconoce una
infección por Borrelia mucho antes que con otros ELISA, Western Blot o técnicas de hemaglutinación que
emplea un antígeno preparado con borreliae sometido a ultrasonido. Durante el curso porsterior de la
infección se forman anticuerpos contra otros antígenos. Esto resulta en una disminución de la
concentración absoluta de anticuerpos contra el fragmento de 14 kDa y el OspC. Sin embargo, estos
anticuerpos no desaparecerá totalmente debido a las infecciones crónicas o persistentes con alto grado de
fiabilidad en su detección.
La prueba Borelia 14 kDa + OspC IgM ELISA es apto para controles de éxito de terapia. En este caso,
debe tomarse en cuenta que la concentración de anticuerpos no decrece significativamente sino hasta 2-4
meses después de que la infección se ha curado. Los resultados de la prueba de IgM se puede incrementar
inespecificamente en gestantes. En tal caso, se aconseja que se debe correlacionar con observaciones y
ensayos en el curso después de 14 días.
15.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE
MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles.
Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES.
La azida y el timerosal en concentraciones > 0.1 % interfieren en este ensayo y pueden conducir a falsos
resultados.
Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo (+/- 20% del esperado) en los
resultados del ensayo en las concentraciones indicadas a continuación.
Hemoglobina
Bilirrubina
Triglicéridos
16.
2.0 mg/mL
0.3 mg/mL
2.5 mg/mL
PRUEBAS FUNCIONALES
Grupo de pacientes
Especificidad Analítica
(Reactividad Cruzada)
Precisión
Intra-Ensayo
n = 20
Inter-Ensayo
n = 20
Linearidad
Comparación del
Método versus ELISA &
Western Blot
Automatización
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Lues (Treponema pallidum)
Rubeola IgM positivo
Parvovirus IgM positivo
Sarampión IgM positivo
CMV IgM/IgG positivo
HSV IgM/IgG positivo
VZV IgM positivo
EBV IgM positivo
Intervalo COI / U/mL
CV (%)
< 1 / < 10
> 1 / > 10
0.3 / 3.3
0.5 / 5
2.8 / 35
5.2 / 89
Intervalo(DO)
2.0 – 0.3
Resultados negativos /
muestras probadas
8/8
7/9
18/19
8/8
8/8
8/8
15/18
6/8
4.4
1.3
9.9
8.3
4.3
6.6
Rango de dilución en serie
1:1 – 1:16
Sensitividad rel.
100 %
Especificidad rel.
> 95 %
Intervalo (%)
80 – 120
Este prueba ha sido validada con, p.e., BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols)
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Determinación de
LCR
17.
ESPAÑOL
El ELISA para la IgM especifica de Lyme se ha realizado con suero y LCR en 5 diluciones
cada uno: Suero 1:100-1:1600 y LCR 1:2-1:32. Los pares Suero/LCR han sido tomados el
mismo dia y la determinación se ha basado en la evalución el programa para el diagnóstico
con LCR del professor Reiber. Para la evaluación de los pares de Suero/LCR Líquido
cefaloraquídeo lumbar fue utilizado IgM especifica con y sin diffusion patológica desde la
sangre al cerebro. Todos los resultados de las pruebas de ELISA en IBL International se
ajustan a los síntomas clínicos de las pruebas de referencia.
REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO
1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. P., Diagnosis of Lyme Borreliosis, Clin.
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(in Englisch via Internet unter DGHM.org oder NRZ-Borrelien.LMU.de).
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Ensaio imunoenzimático para diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa ou quantitativa de
anticorpos do tipo IgM contra os antigénios 14 kDa e OspC da Borrelia burgdorferi no soro humano, plasma
e líquido cefalorraquidiano. São detectadas as infecções com as três subespécies de B. burgdorferi (garinii,
afzelii e sensu strictu).
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A Borrelia burgdorferi, uma bactéria da família Spirochaetaceae, é o agente etiológico da doença de Lyme
(Borreliose) sendo a doença mais comum na Europa e nos EUA transmitida pela carraça (Ixodes sp.) A
borreliose de Lyme é uma doença multi-sistémica com um espectro largo de sintomas clínicos. Um sintoma
típico da fase aguda é o eritema chronicum migrans (ECM), muitas vezes acompanhado por sintomas
semelhantes aos da gripe. Em estados mais avançados da doença pode ocorrer artrite, cardite bem como
manifestações neurológicas e dermatológicas. A borreliose de Lyme pode ser tratada com antibióticos em
todas as fases. Assim sendo, um diagnóstico laboratorial de borreliose seguro e sensível, com capacidade
de detectar os estados mais precoces da doença, é da maior importância, uma vez que o tratamento
precoce é o mais conveniente.
Os anticorpos IgM aparecem normalmente três semanas após a infecção, os anticorpos IgG após quatro a
seis semanas. A resposta imunitária precoce é principalmente direccionada contra o peptídeo da flagelina
(41 kDa) e contra a OspC (Proteína C da Superfície externa – Outer surface protein C, 23 kDa) e alastra
depois para mais proteínas bacterianas.
Neste teste o fragmento da flagelina 14 kDa de Borrelia burgdorferi específico é utilizada com uma proteína
recombinante para a ligação dos anticorpos. Este recombinante fragmento da flagelina, producido em E.coli
é encontrado para ser idêntico em todos os três subespécies da borrelia. Os resultados dos extensos
estudos comparativos com ELISA, IFA e testes de aglutinação bem com Western Blot demonstram que o
teste 14 kDa IgM ELISA mostra uma elevada especificidade diagnóstica bem como uma sensibilidade
aumentada diagnóstica para a resposta imunitária precoce à borreliose de Lyme. Adicionalmente à
fragmento recombinante da flagelina 14 kDa, é utilizada a proteína nativa OspC com antigénio de
revestimento no teste Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA.
Normalmente a fase aguda é indicada pelos elevados títulos de anticorpos IgM. Os títulos elevados de IgG
podem ocorrer com ou sem a presença de anticorpos IgM quando a borreliose está em declínio (devido a
terapia ou espontaneamente) ou durante a fase crónica.
O teste Borrelia IgM pode ser usado para o diagnóstico da borreliose de Lyme em fase aguda ou crónica da
doença ambas requerendo terapêutica. Os pacientes com borreliose em declínio que já não requerem
terapêutica não mostraram resultados positivos.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica
de sandwich. Os poços são revestidos com antigénios. Os anticorpos específicos da amostra ligados ao
antigénio que reveste os poços, são detectados por um anticorpo secundário conjugado com uma enzima
(E-Ab) específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato a intensidade de cor desenvolvida é
proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos. Os resultados das amostras podem ser
determinados directamente utilizando um índice de Cut-off.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
PORTUGUÊS
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de
produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram
considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto
a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com
potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou
da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos
nas secções correspondentes.
As tiras da microplaca são estáveis até 3 meses depois de separadas, no saco hermeticamente fechado
quando armazenados de 2 a 8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro, Plasma (EDTA)
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade
química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize
amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser
centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento Soro/Plasma/LCR:
2-8°C
Estabilidade Soro/Plasma/LCR:
5 dias
7.
≤ -20°C
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
(Alíquotas)
12 meses
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP IgM
1 x 12 mL
ENZCONJ IgM
1 x 4 x 1.5 mL
CAL A-D
Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos.
Conjugado Enzimático
Pronto a usar. Colorido vermelho. Contêm: anti-humano IgM, conjugado com
peroxidase.
Padrão A-D
2; 10; 25; 100 U/mL
Standard B = Cut-off Standard
Pronto a usar. Contêm: IgM anticorpos contra B. burgdorferi, estabilizantes.
1 x 1.5 mL
CONTROL +
1 x 1.5 mL
CONTROL -
1 x 100 mL
DILBUF M
1 x 100 mL
1 x 15 mL
1 x 15 mL
8.
Controlo Positivo
Pronto a usar. Contêm: IgM anticorpos contra B. burgdorferi, estabilizantes.
Controlo Negativo
Pronto a usar. Contêm: Soro humano, estabilizantes.
Tampão de Diluição IgM
Pronto a usar. Cor azul. Contêm: Absorvente de factores reumatóides (cabra antihumano IgG).
Tampão de Lavagem, Concentrado (10x)
WASHBUF CONC Contêm: tampão fosfato.
Solução de Substrato TMB
TMB SUBS
Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes.
TMB STOP
Solução de Paragem TMB
Pronto a usar. 1 M H2SO4.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 10; 100; 1000 µL
(ajustável)
2. Vortex
3. Tubos (≥ 1 mL) para diluição de amostras
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
PORTUGUÊS
4.
5.
6.
7.
Incubador, 37 °C
Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de
referência 600-650 nm)
8. Água bidestilada ou bi-destilada
9. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
9.
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. Preparação de componentes concentrados
Diluir /
dissolver
Componente
100 mL
WASHBUF
CONC
Diluente Relação
juntar
1000 mL
agua
bidest.
1:10
Observações
Armazenamento
Estabilidade
Desfazer cristais a
18-25°C.
2-8 °C
2 meses
10.2. Diluição de Amostras
10.2.1. Soro, Plasma
Amostra
Soro, Plasma
diluir
com
Relação
Observações
geralmente
DILBUF
1:101
p.ex. 10 µL + 1 mL
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas.
10.2.2. Soro/LCR
Para diagnóstico no líquido cefalorraquidiano (LCR) de acordo com Reiber, é necessário usar
concentrações aproximadamente similares ou índices de Cut-off (ICO) no intervalo de DO de 1.0 até 0.1
para soro e LCR. Isto é normalmente conseguido com as seguintes diluições:
Amostra
diluir
com
Relação
Observações
Soro
geralmente
DILBUF
1:401
p.ex. 5 µL + 2 mL
LCR
geralmente
DILBUF
1:4
50 µL + 150 µL
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PORTUGUÊS
Os índices de Cut-off são corrigidos pelos factores de diluição em relação à diluição 1:101: O índice de Cutoff para a diluição 1:401 de soro deve ser multiplicada por 4 e a diluição de 1:4 de LCR deve ser dividida
por 25.
Deve ser realizada uma série de diluições, se os resultados das amostras não estiverem dentro do intervalo
de 2.0 a 0.3 DO.
São recomendadas as seguintes diluições:
Soro
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
LCR
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
As amostras de IgM não devem ser tratadas com Absorvente RF, porque este já faz parte do Tampão
Diluente.
O tempo máximo para dispensa das amostras deve ser < 15- 20 minutos.
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Dispense 100 µL de cada Padrão, Controlo e amostra diluída nos respectivos poços da
Microplaca. Para o teste qualtitativo só é utilizado o Padrão B (Padrão de Cut-off).
Incubar 1 h a 37 °C. Utilize folha adesiva ou câmara húmida.
Retire a folha. Elimine a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Solução de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
Dispense 100 µL do Conjugado Enzimático em cada poço.
Incube durante 30 min a 37 °C. Utilize folha adesiva ou câmara húmida.
Retire a folha. Elimine a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Solução de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
Para adicionar o Substrato e a Solução de Paragem, utilize, se possível, uma micropipeta de 8
canais. A pipetagem deve ser efectuada nos mesmos intervalos para o substrato e para a solução
de paragem. Utilize a pipetagem positiva e evite a formação de bolhas.
Dispense 100 µL de Solução de Substrato TMB em todos os poços.
Incube 30 min à TA no escuro.
Pare a reacção do substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB em todos os poços.
Agite ligeiramente a placa para misturar brevemente o seu conteúdo.
Meça a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (comprimento de onda de referência:
600-650 nm) até 60 min após a adição da Solução de Paragem.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além
disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis
equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de
acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de
aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é
válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em
ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
A avaliação do teste pode ser realizada qualitativamente ou quantitativamente.
13.1. Avaliação Qualitativa
O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a
partir das densidades ópticas médias da amostra e do valor do cut-off. Se a densidade óptica da amostra
estiver num intervalo de 10 % á volta do valor de cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada
como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas.
Exemplo Típico:
Cut-off = DO (Padrão B, Padrão cut-off) = 0.45
DO amostras = 0.60
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PORTUGUÊS
Índice cut-off (COI): 0.60 / 0.45 = 1.33. A amostra é positiva.
13.2. Avaliação Quantitativa
A DO dos padrões obtidas (eixo dos y, linear) são colocadas em gráfico face à sua concentração (eixo dos
x, logaritmo), quer em papel semi-logarítmico ou utilizando um método automático. Um bom ajuste é
conseguido utilizando interpolação cubic spline, 4 parâmetros ou modelo Logit-Log.
Para o cálculo da curva de calibração deve usar todos os sinais dos padrões (pode ser omitido um outlier
óbvio e pode ser usado o valor único mais plausível).
A concentração da amostra pode ser lida a partir da curva de calibração.
A diluição inicial foi tida em consideração quando são lidos os resultados do gráfico. Os resultados de
amostras com uma pré-diluição superior devem ser multiplicados pelo factor de diluição.
As amostras que evidenciam concentrações acima do padrão mais alto devem ser diluídas como descrito
nas INSTRUÇÕES DE PREPARAÇÃO PRÉVIA DO TESTE e novamente testadas.
Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
U/mL
DOMédia
A
2
0.011
B
10
0.414
C
25
0.856
D
100
2.167
(OD)
2.500
Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
1
14.
10
100
(U/mL)
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS / VALORES ESPERADOS
Método
Quantitativa
(Curva Padrão):
Qualitativa (Cut-off
Index, COI):
Intervalo
> 11 U/mL
9 – 11 U/mL
< 9 U/mL
> 1.1
0.9 – 1.1
< 0.9
Interpretação
positivo
limite
negativo
positivo
limite
negativo
Os resultados por si só não
devem ser a única razão para
qualquer acção terapêutica e
deverão ser correlacionados
com outras observações
clínicas e testes de
diagnóstico.
No caso de resultados de IgM negativos com resultados de IgG negativos, uma borreliose aguda é
improvável. No entanto, uma infecção recente não pode ser totalmente excluída se a amostra for colhida
antes de três semanas após a infecção porque nesse período não há a formação de anticorpos específicos.
Se a amostra for equívoca ou positiva para IgG, o resultado indica uma infecção crónica ou tardia bem
como estimulação de anticorpos policlonais causada por outras infecções. A estimulação policlonal pode
ser excluída por Western Blot. Os resultados devem ser confirmados após 14 dias.
Os resultados de IgM equívocos ou no limite acompanhados de resultados de IgG negativos podem
ocorrer em situações de infecção aguda e devem ser confirmados após 14 dias (títulos constantes ou
aumentados) ou por Western Blot. Se os resultados de IgG são positivos ou equívocos são indicadores de
uma infecção aguda persistente com necessidade de terapêutica. No entanto deve ser excluída a hipótese
de estimulação policlonal como referido acima.
Os resultados de IgM positivos com resultados de IgG coincidentes são indicativos de uma infecção
aguda em fase precoce. Resultados de IgM positivos com resultados de IgG positivos ou equívocos são
indicadores de infecção aguda persistente.
O teste Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA mostra elevada sensibilidade e especificidade para a
detecção da resposta imunitária precoce na infecção por Borrelia burgdorferi. Devido à utilização do
fragmento 14 kDa recombinante da flagelina da Borrelia e a OspC nativa purificada, contra as quais a
resposta imunitária é maioritariamente dirigida, este teste reconhece uma infecção por Borrelia mais cedo
que outras técnicas de ELISA, hemaglutinação ou Western Blot que utilizam um preparado de borrelia por
ultra-sons. Durante o seguimento da infecção são formados anticorpos contra outros antigénios. Este facto
resulta numa diminuição da concentração absoluta de anticorpos contra o fragmento 14 kDa e contra a
OspC. No entanto, estes anticorpos não desaparecem totalmente, pelo que também as infecções crónicas
ou persistentes podem ser detectadas com elevada fiabilidade.
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
PORTUGUÊS
O teste Borrelia 14 kDa + OspC IgM ELISA também é adequado para o controlo de seguimento do
sucesso da terapêutica. Neste caso deve ser tido em consideração que os títulos de anticorpos não
diminuem significativamente até 2 – 4 meses após a infecção estar curada.
Os resultados do teste IgM podem ser aumentados inespecificamente em grávidas. Nestes casos é
aconselhável fazer uma confirmação dos resultados com um Blot e a observação do seu curso após 14
dias.
15.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/- 20% do esperado nos
resultados do teste até às concentrações descritas em baixo:
Hemoglobina
Bilirrubina
Triglicéridos
16.
2.0 mg/mL
0.3 mg/mL
2.5 mg/mL
DESEMPENHO
Resultados Negativos /
amostras positivas/testadas
Lues (Treponema pallidum)
8/8
Rubéola IgM positivo
7/9
Parvovirus IgM positivo
18/19
Sarampo IgM positivo
8/8
CMV IgM/IgG positivo
8/8
HSV IgM/IgG positivo
8/8
VZV IgM positivo
15/18
EBV IgM positivo
6/8
Intervalo COI / U/mL
CV (%)
< 1 / < 10
4.4
> 1 / > 10
1.3
0.3 / 3.3
9.9
0.5 / 5
8.3
2.8 / 35
4.3
5.2 / 89
6.6
Intervalo (DO)
Intervalo de diluição em série Intervalo (%)
2.0 – 0.3
1:1 – 1:16
80 – 120
Sensibilidade rel.
100 %
Especificidade rel.
> 95 %
Este teste foi validado com, p.ex., BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols)
Grupo de Pacientes
Especificidade Analítica
(Reactividade Cruzada)
Precisão
Intra-Ensaio n = 20
Inter-Ensaio n = 20
Linearidade
Comparação Método Usado
versus ELISA & Western Blot
Automação
Determinação LCR
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O teste ELISA para a IgG foi realizado com soro e LCR em 5 diluições
apropriadas cada: Soro 1:100 – 1:1600 e LCR 1:2 – 1:32. Os pares
Soro/LCR foram colhidos no mesmo dia e a determinação foi baseada no
programa de avaliação do Prof. Reiber. Para a avaliação foram colhidos
pares soro/LCR com produção específica de IgG para a doença de Lyme
com ou sem taxa de difusão patológica de sangue para o cérebro. Todos
os resultados do teste ELISA IBL International estiveram de acordo com
os sintomas clínicos e os resultados dos testes de referência
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Borrelia 14kDa + OspC IgM ELISA (RE57211)
17.
PORTUGUÊS
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(in Englisch via Internet unter DGHM.org oder NRZ-Borrelien.LMU.de).
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Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
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In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
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luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
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Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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