do arquivo - Programas de Pós

Tese de Doutorado
DISFUNÇÃO AUTONÔMICA CARDÍACA NA INSUFICIÊNCIA
OVARIANA PRIMÁRIA
Silvia Goldmeier
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL
FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CARDIOLOGIA
DISFUNÇÃO AUTONÔMICA CARDÍACA NA INSUFICIÊNCIA
OVARIANA PRIMARIA
Autor: Silvia Goldmeier
Orientadora Dra. Maria Claudia Costa Irigoyen
Co orientador Rodrigo Della Méa Plentz
Co orientador Karina Rabello Casali
TESE submetida como requisito para obtenção do grau
de Doutor ao programa de Pós-Graduação em Ciências
da saúde, Área de Concentração: Cardiologia. Da
Fundação
Universitária
de
Cardiologia/Instituto
Cardiologia do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre, 2010
de
S587d
Goldmeier, Silvia.
Disfunção autonômica cardíaca na insuficiência ovariana
primária / Silvia Goldmeier; orientação [por] Maria Claudia Costa
Irigoyen; co-orientação [por] Rodrigo Della Méa Plentz; Karina
Rabello Casali – Porto Alegre, 2010.
130 f ; tab.
Tese (Doutorado) - Instituto de Cardiologia do Rio Grande
do Sul / Fundação Universitária de Cardiologia - Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2010.
1.Insuficiência ovariana primária.2.Mulheres.3.Sistema
nervoso autônomo.4.Estresse oxidativo.5.Hormônios.
6.Endotélio.I.Maria Claudia Costa Irigoyen.II.Rodrigo Della Mea
Plentz.III.Karina Rabello Casali. IV.Título.
CDU: 616.12-008.6:618-11
Bibliotecária Responsável: Marlene Tavares Sodré da Silva
CRB 10/1850
“Ao meu esposo, por ser meu admirador, e ainda acreditar que vale a pena a
convivência, aos meus filhos aos quais contribui com a formação e seguiram
neste caminho”,
Dedico meu trabalho
AGRADECIMENTOS:
Aos meus pais por me mostrarem o caminho ao qual não tiveram a
oportunidade de trilhar.
À Profª Dra Maria Claudia Costa Irigoyen, por acreditar que o
conhecimento é um bem sagrado, que deve ser apropriado, independente da
formação e socializado.
Ao PPG Ciências da Saúde pelo incentivo como aluna.
As minhas colegas Liliana Cavalheiro Boll e Giancarla Sabio de Souza
que não mediram esforços pessois para me auxiliar e desenvolver novas
técnicas.
Aos alunos Graciele Sbruzzi e Thiago Dipp no despreendimento e
presteza às técnicas desenvolvidas no laboratório.
As funcionárias da biblioteca pela busca constante das referencias, ao
Mauricio Mesquita Reche incansável nas orientações da editoração e a Isabel
Cristina Lameirinhas pela disponibilidade e altruísmo.
LISTA DE ABREVIATURAS
AHA-Associação Americana do Coração
AVE-Acidente Vascular Encefálico
Cat-Catalase
CC-Circunferencia da Cintura
CO-Concepcional
COQH2 – Coenzima Q-citocromo c redutase
Cr- Creatinina
CT-Colesterol Total
DAC-Doença Arterial Coronariana
DAP-Doença Arterial Periférica
DCV-Doença Cardiovascular
DEAS- Dehidroepiandrosterona
DM- Diabete Melito
DNA-Ácido Desoxirribonucléico
EC SOD-SOD Extracelular
E2 - Estradiol
EDRF- Fator de Relaxamento Derivado do Endotélio
EIOP- Insuficiência Ovariana Primária Esperimental
EROs-Espécies Reativa do Oxigênio
Erα-Estradiol α
ERβ-Estradiol β
FC-Frequência Cardíaca
FMD-Dilatação Mediada pelo Fluxo
FOP-Falência Ovariana Prematura
FSH-Hormônio Folículo Estimulante
GCL- Glutamato de Cisteína Ligase
GPx- Glutadiona Peroxidase
GR - Glutadiona Redutase
GSH- Glutadiona Reduzida
GSSG- Glutadiona Oxidada
GST- Glutadiona S Transferase
GTN-Nitrato de Glicerina
H+ - Radical Hidroxila
HL-Colesterol de Alta Densidade
HO2- Hidroperoxila
H2O2- Peróxido Hidrogenio
HAS- Hipertensão Arterial Sistêmica
HDL-Colesterol de Alta Densidade
HERS- Estudo do Coração e Reposição de Estrógeno e Progesterona
HF- Alta Frequência
IAM- Infarto Agudo do Miocárdio
IMC- Índice de Massa Corporal
INTERHEART- Estudo Internacional do Coração
IOP- Insuficiência Ovariana Primária
K-Potássio
LDL-Colesterol de Baixa Densidade
LF-Baixa Frequência
LH-Hormonio Luteinizante
NA- Sódio
NADPH- Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
OH - Radical Hidroxila
O2- Anion Superóxido
ON- Óxido Nítrico
PA-Pressão Arterial
PAD-Pressão Arterial Diastólica
PAM-Pressão Arterial Média
PAF-Fator Ativador Plaquetário
PGI2- Prostaciclinas
PH- Potencial Hidrogeniônico
REDOX- Sinalizador Intracelular
RLs-Radicais Livres
RR-Intervalo entre batimentos cardíacos
S-Ratas Sham
SBR-Sensibilidade Baroreflexa
SNC-Sistema Nervoso Central
SOD-Superóxido Dismutase
SNP-Sistema Nervoso Parassimpático
SNS-Sistema Nervoso Simpático
TE-Terapia com Estrógeno
TH- Terapia Hormonal
TG-Triglicerídeos
TRE- Terapia de Reposição Estrógeno
TXA-2- Tromboxane A
U-Uréia
VFC- Variabilidade da Freqüência Cardíaca
VPA- Variabilidade da Pressão Arterial
WHI- Iniciativo da Saúde da Mulher
SUMÁRIO
1.REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................................
1.1 DOENÇA CARDIOVASCULAR...........................................................................
1.2 O ESTRÓGENO E A DOENÇA CARDIOVASCULAR NAS MULHERES...........
1.2.1 O Estrógeno e o Endotélio......................................................................
1.2.2 O Estrógeno Como Fator Cardioprotetor..............................................
1.3 TERAPIA HORMONAL E A DOENÇA CARDIOVASCULAR .............................
1.4 ESTRESSE OXIDATIVO.....................................................................................
1.4.1 As Espécies Reativas de Oxigênio.........................................................
1.4.2 Anti-Oxidantes Enzimáticos....................................................................
1.4.3 Antioxidantes Não Enzimáticos..............................................................
1.5 DISFUNÇÃO AUTONÔMICA, DOENÇAS CARDIOVASCULARES E
ESTRESSE OXIDATIVO ....................................................................................
1.6 A INSUFICIÊNCIA OVARIANA PRIMÁRIA.........................................................
1.6.1. Disfunção Endotelial Nas Mulheres Com IOP.......................................
1.7 LIÇÕES DOS MODELOS EXPERIMENTAIS......................................................
2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................
3. OBJETIVOS.............................................................................................................
3.1 OBJETIVO GERAL ...........................................................................................
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................
5. ARTIGO....................................................................................................................
5.1 RESUMO ............................................................................................................
5.2 INTRODUÇÃO.....................................................................................................
5.3 MÉTODO.............................................................................................................
5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA.....................................................................................
5.5 RESULTADOS....................................................................................................
5.6 DISCUSSÃO.......................................................................................................
5.7 REFERÊNCIAS...................................................................................................
5.8 LIMITAÇÕES DO ESTUDO.................................................................................
5.9 PERSPECTIVAS.................................................................................................
5.10 FONTES FINANCIADORAS..............................................................................
5.11REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
5.12 LEGENDAS DAS FIGURAS..............................................................................
5.13 TABELAS ..........................................................................................................
5.14 FIGURAS................................................................................................... ........
6. ARTIGO EM INGLÊS ……………………………………………………………………
6.1 ABSTRACT ……………………………………………………………………………
6.2 INTRODUCTION………………………………………………………………………
6.3 METHODS……………………………………………………………………………..
6.4 STATISTICAL ANALYSIS……………………………………………………………
6.5 RESULTS………………………………………………………………………………
6.6 DISCUSSION…………………………………………………………………………..
6.7 LIMITATION OF THE STUDY………………………………………………………..
6.8 PERSPECTIVES………………………………………………………………………
1
1
3
6
8
10
12
14
17
21
23
27
30
33
36
37
37
37
38
53
55
57
59
66
66
68
73
73
73
75
76
79
80
86
88
90
92
94
100
100
102
107
107
6.9 SOURCES OF FUNDING....................................................................................
6.10 REFERENCES……………………………………………………………………….
6.11 FIGURES CAPTIONS.......................................................................................
6.12 TABLES.............................................................................................................
6.13 FIGURES...........................................................................................................
108
109
112
113
119
REFERENCIAL TEÓRICO
1
1- DOENÇA CARDIOVASCULAR
A doença cardiovascular (DCV), é responsável por um terço dos óbitos
do mundo e lidera a taxa global de doenças 1. Nas mulheres, incluindo a
doença arterial coronariana (DAC) o acidente vascular encefálico (AVE) e a
doença arterial periférica (DAP) ela lidera entre as causas de óbito
2,3,4 ,
. Os
últimos dados disponíveis da Organização Mundial de Saúde indicam que
16,6 milhões de pessoas em todo o mundo morrem de doenças
cardiovasculares. No Brasil, segundo o Datasus a taxa de mortalidade por
doenças isquêmicas do coração atinge um percentual na ordem de 48% 5.
A partir dos anos 60, com a entrada das mulheres no mercado de
trabalho e, conseqüentemente, com maior exposição ao estresse, fumo e
maus hábitos alimentares, a taxa de mortalidade devido às doenças
cardiovasculares em mulheres rapidamente se elevou. No Brasil, esse índice
aumentou de 10 para 25% entre os anos 60 e 70
6,8
.
Para as mulheres, a taxa de eventos cardiovasculares começa a
aumentar na época da menopausa, e avança substancialmente com o
aumento da idade
9,10
. A partir da menopausa, a redução da atividade
ovariana e, portanto do nível dos hormônios estrogênicos, tem sido associada
não só com o envelhecimento, mas também com o aumento do peso
corporal, da prevalência de diabetes tipo 2 e de hipertensão arterial
11
, todos
fatores de risco para o desenvolvimento da doença cardiovascular.Em
adição, a alteração do perfil lipídico bem como a disfunção endotelial
vascular11 vem contribuindo para o desenvolvimento da aterosclerose
12
e
2
conseqüentemente da doença arterial. O número de óbitos ultrapassa as 240
000 anualmente, no entanto, a prevenção dos fatores de risco coronariano
continua a ser pouco valorizada. Em fevereiro de 2004, a American Heart
Association (AHA) publicou as primeiras diretrizes baseadas em evidências
para a prevenção de doenças cardiovasculares nas mulheres, que consiste
de um conjunto de recomendações clínicas adaptadas ao individuo com
evidencias de risco13.
3
1.2 O ESTRÓGENO E A DOENÇA CARDIOVASCULAR NAS MULHERES
O aumento da incidência de doenças isquêmicas e de mortalidade
após o inicio da menopausa pode ser atribuída às alterações relacionadas à
idade, aos fatores de risco que resultam em um aumento do risco de doença
arterial coronariana e a redução dos níveis séricos de estrogênios
endógenos 14. A equivalência nas taxas de eventos cardiovasculares entre os
sexos coincide com o advento da menopausa e conseqüentemente com a
privação estrogênica15. Sendo assim, a proteção cardiovascular que as
mulheres apresentam até a menopausa pode ser atribuída aos hormônios
estrogênicos 9.
Vários estudos observacionais, ao longo dos últimos anos têm
demonstrado uma redução do risco coronariano em mulheres que recebem
terapia de reposição do estrogênio na pós-menopausa, sugerindo que o
estrogênio tem um efeito cardioprotetor
9,10
. Por outro lado, após a publicação
dos resultados desfavoráveis obtidos no estudo clínico HERS (Heart and
Estrogen/Progestin
Replacement
Study)16
e
WHI
(Women’s
Health
Iniciative)17 sobre reposição hormonal (estrógeno e progesterona) após a
menopausa os clínicos em geral, e as pacientes em particular, passaram a ter
muita cautela na decisão de repor os hormônios
não produzidos
fisiologicamente. A busca por explicações para tal resultado concluiu
recentemente que era a idade elevada nestas mulheres. Esta hipótese é
baseada na tese de que os estudos WHI e HERS falharam em mostrar
cardioproteção
porque as mulheres com mais idade,
envolvidas nos
4
estudos, que já tinham aterosclerose,
respondiam mal à reposição com
estrógeno18. Baseada nessa teoria a terapia com estrógeno deveria ser
iniciada tão logo ao início da menopausa. Entretanto, permanece a questão
de quanto essas evidencias são suficientes para justificar a “timing
hypothesis”!
18
.
O estrogênio é conhecido por diminuir lipoproteína de baixa densidade
(LDL) e aumentar a lipoproteína de alta densidade (HDL) na íntima do vaso
que são cruciais para o desenvolvimento do processo aterosclerótico.
Estudos anteriores demonstraram que a diminuição dos níveis de estrogênio
endógeno modificam o perfil lipídico e a função vascular em mulheres pósmenopausa.Em mulheres na pré-menopausa há indícios que os
níveis
lipídicos elevados estejam associados ao hipoestrogenismo19.
Existem evidencias que os níveis séricos de colesterol total (CT), LDL
e triglicerídeos (TG) podem aumentar de 7 a 19% da pré-menopausa para a
pós-menopausa
[H1] Comentário: Item b do REVISOR.
Pág 3, 5ª linha de baixo para cima:
reescrever, não existem estudos
longitudinais transversais
20
. Entretanto, mesmo reconhecendo os efeitos negativos da
deficiência de estrogênio nos níveis de LH e HDL bem como na proliferação
do músculo liso arterial e na secreção de insulina, a prescrição de
estrogênios generalizada não se justifica, especialmente para prevenção
[H2] Comentário: Item c REVISOR
secundária. De fato, como falado anteriormente, as evidencias de proteção
Pág 4, segunda linha: trocar a expressão ...
nem mesmo para fins.. por .. especialmente
fornecida pela reposição hormonal existem, mas ainda são controversas tanto
quanto as doses e as vias de administração 21.
Segundo Fuchs
22
, em 2009, após os dois primeiros anos do início da
menopausa é o momento no qual os ginecologistas indicam a terapia de
reposição hormonal (TH)
22
. Mesmo nesta fase, a TH não é indicada para a
prevenção cardiovascular. Sendo assim, as análises de subgrupo, no estudo
[H3] Comentário: Inserir aqui a
Referencia do FUCHS. Item d do
REVISOR. Vai lá na bibliografia e veja que
para todo o parágrafo só consta a refrencia
23 INSERIDO
5
WHI, demonstraram que os riscos de infarto, em mulheres com menos de 10
anos do inicio da menopausa, não são evidentes
22
.
Na tentativa de reduzir esse risco, a reposição de esteróides sexuais
geralmente é oferecida na forma de TH projetado para as mulheres pós
menopausadas
23
.
Em uma coorte, (The Mayo Clinic Cohort Study,1950 a 1987) foram
incluidas 1.274 mulheres que tinham se submetido a ovariectomia unilateral ,
1.091 mulheres com ovariectomia bilateral e 2383 controles antes do início
da menopausa. O estudo teve como objetivo Investigar a mortalidade
associada a doenças cardiovasculares e o efeito do tratamento com
estrogênio nas mulheres submetidas à ovariectomia unilateral ou bilateral
antes da menopausa. Os resultados mostraram que as mulheres que foram
submetidas a ovariectomia bilateral antes dos 45 anos
apresentaram um
aumento da mortalidade associada à doença cardiovascular em comparação
com as mulheres controle (p=0,04). Além disso, a mortalidade foi
significativamente maior em mulheres que não foram tratadas com estrogênio
até a idade de 45 anos ou mais (p = 0,001), em oposição aquelas que
sofreram ovariectomia unilateral e portanto produziam estrógenos ou que
foram tratadas com estrogênio ( p = 0,28)24.
6
1.2.1 O Estrógeno e o Endotélio
O endotélio é a camada celular mais interna da parede do vaso e um
regulador importante da homeostase vascular. Tem a capacidade de manter
o equilíbrio entre a vasodilatação e a vasoconstrição inibindo a proliferação e
migração das células da musculatura lisa vascular evitando a trombogênese
e fibrinólise25. O endotélio tem como funções principais o controle do tônus
vasomotor, a manutenção do sangue no estado fluído (hemostase) o controle
do fluxo de nutrientes e células, a permeabilidade vascular, a resposta
inflamatória e a promoção da angiogênese26.
No controle do tônus vascular, o endotélio secreta substâncias
vasodilatadoras como o óxido nítrico (ON), as prostaciclinas (PGI2), o EDHF
(fator hiperpolarizante derivado do endotélio) e substâncias vasoconstritoras
como as endotelinas, tromboxane (TXA-2) e o fator ativador plaquetário
(PAF). O endotélio normal e sadio exerce a função de promover a
vasodilatação. Na menopausa pode ocorrer a disfunção endotelial que é um
passo inicial para o desenvolvimento da aterosclerose. Por outro lado, a TH
tem sido associada com uma melhoria nos marcadores de lesão
cardiovascular incluindo aqueles que refletem os efeitos diretos sobre o
endotélio vascular 18.
As lipoproteínas desempenham um papel importante no processo da
aterosclerose e na menopausa, as mulheres experimentam um desequilíbrio
na produção destes, elevando os valores do CT da LDL e dos TG. Estas
alterações em geral, são consideradas como o resultado do ganho de peso e
do envelhecimento, quando ocorre o depósito de gordura abdominal
aumentada e perda da função ovariana. Os benefícios da função ovariana
[H4] Comentário: Item e do REVISOR
. Pág 5, último parágrafo: Reescrever a
frase “Já o endotélio..” A frase atual
contém erros conceituais graves
7
normal nos lipídios e suas lipoproteínas são geralmente atribuídos à
produção de estrogênios endógenos. Os receptores dos estrógenos tem uma
participação na regulação dos receptores de LDL no fígado e estão
associados a um aumento da depuração das partículas de LDL. A diminuição
nos níveis de estrogênio após a menopausa proporciona um desequilíbrio na
regulação da atividade do receptor do LDL elevando as concentrações do
LDL e TG no plasma 20.
8
1.2.2 O Estrógeno Como Fator Cardioprotetor
A presença de receptores de estrogênio têm sido demonstrada por
diferentes técnicas, em células musculares lisas de várias espécies, incluindo
seres humanos e, mais recentemente, na veia umbilical e nas células
endoteliais da artéria coronariana
27
. A disfunção destas células pelo acúmulo
de LDL oxidado modifica a intima do vaso. O LDL oxidado inibe a produção
de células endoteliais e a resposta ao óxido nítrico(ON). A produção de ON
pelas células endoteliais tem inúmeras funções entre elas a de proteção.
Além de seu efeito inibitório sobre a contratilidade das células musculares
lisas, o ON inibe a expressão de moléculas de adesão endotelial e a
proliferação de células musculares lisas
20
. Existem receptores para
estrogênio e progesterona em todas as camadas dos vasos, particularmente
na musculatura lisa. Artérias sadias expressam receptores de estrógeno (E2)
com muita intensidade, e quando envelhecem ou se tornam ateroscleróticas
vão perdendo esta expressão. Os estrogênios exercem efeitos sobre os
vasos de forma direta e indireta: eles induzem a síntese de ON que é um
vasodilatador potente e reduzem a oxidação do LDL e das moléculas de
adesão além da migração de monócitos
Os
receptores
hormonais
28
e
.
especificamente
os
receptores
estrogênicos, foram descrito a cerca de 40 anos. Os receptores de
estrógenos classificam-se em dois tipos: o alfa (ERα) e o beta (ERβ), os
quais são codificados por diferentes genes e sua expressão tissular varia de
tecido para tecido 29.
9
O ERα se expressa predominantemente no aparelho reprodutivo
(útero, mamas, ovários), fígado e sistema nervoso central (SNC). O ERβ se
expressa em outros tecidos como osso, endotélio, pulmões, urogenital, além
dos ovários, SNC e próstata 30, 31.
Talvez estas ações possam explicar a baixa incidência de eventos
cardiovasculares encontrados em mulheres jovens com bons níveis de
estrogênios 32.
10
1.3
TERAPIA HORMONAL E A DOENÇA CARDIOVASCULAR
Após as discussões a respeito dos estudos WHI e HERS e a busca de
estudos mais bem controlados, as evidencias indicam que o efeito da TH na
pós-menopausa sobre a mortalidade por DCV depende de fatores como da
idade do inicio da menopausa e a duração da terapia de reposição (> 6 anos
de uso). O risco associado com TH é raro (menos de 1 caso para cada 1.000
mulheres) e ainda mais raro em mulheres que iniciam TH com idade inferior a
60 anos ou com 5 anos de menopausa. Neste último grupo de mulheres os
sintomas são mais intensos, necessitando alívio mais imediato, tais como
“calorões”cuja terapia mais eficaz continua sendo a reposição com
estrogênio33 .
Muitos estudos têm demonstrado que a incidência de doenças
cardiovasculares aumenta significativamente não só em mulheres após a
menopausa
34,35
, mas também após intervenção cirúrgica (ovariectomia)
36
ou
medicamentosa .Em mulheres jovens cuja inibição da produção hormonal
pelos ovários indica, que o fator idade, não é o único determinante para o
aumento da incidência de doenças cardiovasculares como em mulheres na
menopausa 37.
De fato, embora a idade e o tempo de menopausa estejam altamente
correlacionados, a influência dos hormônios parece ter maior importância do
que idade cronológica na determinação da doença cardiovascular.
Em acordo com essa idéia, as organizações profissionais, incluindo a
Sociedade Norte-Americana de Menopausa, a British Menopause Society e a
Sociedade Internacional de Menopausa recomendam terapia de reposição
11
hormonal para mulheres com menopausa precoce ou insuficiência ovariana
primária38.
Dessa forma, as evidências indicam que a TH pode ser benéfica em
melhorar a disfunção endotelial e o perfil lipídico em mulheres com privação
dos hormônios ovarianos. Entretanto, não se conhece se existiriam outros
riscos residuais associados, como exemplo, o sistema nervoso autônomo.
O estrogênio pode se caracterizar por ter ações duplas e opostas. Por
um lado retarda os estágios inicias da aterosclerose através dos efeitos
benéficos sobre a função endotelial e o perfil lipídico e por outro, uma
situação crítica e aguda ocorre no endotélio na presença de mecanismos prócoagulantes e inflamatórios 39.
[H5] Comentário: Item f do Revisor
Pág 9, 4ª linha corrigir insuficiência
12
1.4 ESTRESSE OXIDATIVO
A formação de radicais livres ocorre por reações de óxido redução que
cedem (reação de oxidação) ou recebem (reação de redução) elétrons. Essas
reações ocorrem continuamente, amplificando, neutralizando e atingindo a
estabilidade do seu processo. O oxigênio é um elemento essencial para a
sobrevivência dos seres aeróbios e o elemento aeróbio tem sido evidenciado
como um importante meio de formação de radicais livres. Cerca de 98% do
oxigênio disponível é reduzido totalmente com a formação de água. Porém,
durante esse processo, são formados compostos intermediários como
radicais superóxido (O-2,), hidroperoxila (HO2), hidroxila(OH) e compostos
como peróxido de hidrogênio (H2O2 ), os quais podem ser neutralizados com
a entrada de elétrons 40.
O organismo humano em situação não patológica possui um equilíbrio
na razão de produção e eliminação de radicais livres. Ao contrário, quando
ocorre um desequilíbrio entre os sistemas pró-oxidantes e antioxidantes, de
maneira que os primeiros sejam predominantes, o organismo encontra-se sob
um estado comumente chamado de estresse oxidativo
41
.
Assim, espécies de radicais livres, denominadas espécies reativas de
oxigênio (EROs) são produzidas naturalmente pela redução incompleta do
oxigênio, gerando espécies que apresentam alta reatividade para outras
biomoléculas, principalmente lipídios, proteinas das membranas celulares,
carboidratos e até mesmo no DNA
42
.
Estudos comprovam que o estresse oxidativo está relacionado com
envelhecimento, atividade física intensa, apoptose, câncer, diabetes mellitus
13
e arterioesclerose. As EROs podem ser geradas de forma endógena durante
o metabolismo celular, ou de forma exógena, como por exposição ao álcool,
fumo, drogas, raios ultravioleta,estilo de vida etc
43
.
Devido à sua interdependência com o metabolismo do oxigênio, as
EROs são continuamente formadas em pequenas quantidades pelos
processos normais do organismo. Entretanto, todas as células possuem um
sistema de defesa antioxidante para reduzir ou eliminar seus efeitos
agressores. Esse sistema está dividido em enzimático, que inclui as enzimas
superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase
(GPx) e o sistema não enzimático, formado por compostos sintetizados pelo
organismo humano (hormônios sexuais, ácido úrico, melatonina etc...)
ingeridos através da dieta normal ou via suplementação (vitamina C, vitamina
E, beta caroteno e grupos fenóis de plantas)
44
.
O estresse oxidativo, o excesso de ferro, a homocisteína, os lipídios
sanguíneos e a gordura abdominal crescem substancialmente com a idade
especialmente após a menopausa devido a queda endógena da produção de
estrógeno 45.
Fatores de risco que promovem as DCV foram identificados no período
da
pós-menopausa
como
hipertensão
arterial,
tabagismo,
diabetes,
hipercolesterolemia e diminuição do estrogênio. Existem vários mecanismos
propostos para explicar a predisposição das mulheres menopausadas à DCV.
Os níveis de peroxidação lipídica durante esses estados são responsáveis,
pelo menos em parte, pelo risco aumentado de DCV em populações de grupo
de risco. A identificação dos níveis de EROs poderia auxiliar
determinação do risco no desenvolvimento de DCV 43.
na
14
1.4.1 As Espécies Reativas de Oxigênio
O oxigênio é essencial para a oxidação de compostos orgânicos e
produção de energia para o metabolismo celular 46. No entanto uma pequena
quantidade do oxigênio consumido (2 a 5%) é reduzido, produzindo uma
variedade de substâncias químicas altamente reativas, as EROs
47
.
O organismo humano sofre ação constante das EROs geradas pelo
processo de
respiração e sinalização celular
48
. As EROs reagem com
lipídeos e com proteínas das membranas celulares, além do DNA. No
entanto, as enzimas SOD, CAT e GPx e sistemas antioxidantes nãoenzimáticos contrabalançam as ações das EROs
49, 50
. Conseqüentemente as
EROs promovem estresse oxidativo quando as defesas antioxidantes da
célula são insuficientes para deter a produção pró-oxidante 51.
As EROs quando geradas em grandes quantidades causam uma
diminuição expressiva do ON, o que induz prejuízo na função endotelial e
cardíaca
52
. O ON pode ser destruído pelo radical superóxido e protegido por
mecanismos antioxidantes como a enzima SOD
col.
55
53, 54
. O estudo de Berry e
mostra que, pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes,
fumantes, e até mesmo no processo fisiológico do envelhecimento, há
relação entre a disfunção vasodilatadora e endotelial com o aumento do
estresse oxidativo.
Os
modelos
animais
de
aterosclerose
produzem
todos
os
componentes da placa e ainda desenvolvem as EROs. A formação da lesão
está associada com a produção de peroxidação lipídica
56
. Efeitos das EROs
no metabolismo celular tem sido bem documentado em uma variedade de
15
espécies. Estas incluem não apenas papéis em apoptose (morte celular
programada), mas também efeitos positivos, tais como a indução de genes
de defesa e de mobilização dos sistemas de transporte de íons
57
.
O oxigênio não é apenas um elemento essencial que cede energia de
forma eficaz para os organismos aeróbios, mas devido ao seu alto potencial
oxidativo também pode ser uma causa potencial de dano. As várias formas
de oxigênio molecular têm sido consideradas como prejudiciais e deletérias
para os componentes essenciais da célula. As EROs são geradas em
condições basais como subprodutos do metabolismo celular, principalmente
nas mitocôndrias. Em torno de 100% do oxigênio utilizado entra na
mitocôndria é reduzido a água ao passar pelo transporte de elétrons da
cadeia respiratória. No entanto, cerca de 1% do transporte de elétrons pode
formar intermediários reduzidos de oxigênio, como o anion superóxido (O2-),
o H2O2 e radicais hidroxila (H+) 58.
Considerando o possível envolvimento do estresse oxidativo nas
disfunções observadas no climatério, vale destacar que o estrogênio fornece
cardioproteção por sua composição antioxidante agindo como neutralizador
dos radicais livres
59
. No aspecto bioquímico, o estrogênio possui estrutura
hidrofenólica, na qual o hidrogênio é doado para uma molécula instável,
tornando-se um radical menos lesivo, estabilizando a molécula e retirando do
meio um radical livre. Dessa forma, o estrogênio tem ação antioxidante
importante agindo como “scavenger” ou “o que captura” EROs, estimulando a
ativação de mais enzimas antioxidantes, aumentando a expressão da enzima
SOD, e concomitantemente aumentando a produção de mediadores
vasoativos derivados do endotélio diminuindo a expressão de enzimas pró-
16
oxidantes como NADPH (Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato)
oxidase59.
Os resultados obtidos em modelos animais com aterogênese nos quais
se observaram regressão da doença em presença da reperfusão do vaso,
não foram confirmadas na maioria de ensaios clínicos com o uso de
antioxidantes, que chegaram a resultados decepcionantes
60
.
Figure 1. Development of atherosclerosis. ROS produced by endothelial cells,SMCs, and macrophages oxidize LDL
in the subendothelial space, at the sites of endothelial damage, initiating events that culminate in the formation of a
fibrous plaque. Rupture of fibrous plaque leads to thrombus formation and occlusion of the vessel.
17
1.4.2 Anti-oxidantes Enzimáticos
As células possuem sistemas antioxidantes enzimático ou nãoenzimático, capazes de responder a variação do equilíbrio redox em favor da
oxidação. Como já se sabe o estresse oxidativo promovido pela EROs, ocorre
quando as defesas antioxidantes da célula são insuficientes para neutralizar a
produção de elementos pró-oxidantes. Grandes quantidades de EROs,
incluindo o ânion superóxido e o H2O2, são produzidas nas células incluindo
as endoteliais e podem também atuar como importantes sinalizadores
intracelulares
61
. Para estar protegido contra os efeitos potencialmente
nocivos das EROs, vários organismos aeróbios evoluíram para neutralizar
seus efeitos.
Uma variedade de sistemas enzimáticos catalisa a redução univalente
do oxigênio molecular a O-2, como a xantina oxidase, aldeídos oxidase, di62
hidro-orótico desidrogenase, flavinas desidrogenases e peroxidases
. As
enzimas que catalisam a formação de prostaglandinas (ciclo-oxigenases) e
leucotrienos (lipoxigenase) são também fontes de superóxido
63
. Essa
redução univalente ocorre tanto em sistemas não-enzimáticos como durante
reações de autooxidação incluindo aquelas que envolvem catecolaminas,
flavinas e ferridoxinas reduzidas. Uma importante fonte de radical superóxido
é o sistema mitocondrial de transporte de elétrons
62
. O radical superóxido é
instável com vida média de milissegundos em pH neutro. É instável em meio
aquoso, e em forma espontânea se dismuta para produzir peróxidos e
oxigênio molecular (Ver reações abaixo).
18
A reação de dismutação do superóxido é a maior fonte de H2 O2 no
organismo
62
. O H2 O2 pode ser formado como resultado de dois tipos de
reação: pela redução divalente do oxigênio molecular ou a partir da
dismutação do ânion radical superóxido. O primeiro caso ocorre em
organelas especializadas chamadas peroxissomas através de oxidases como
a D-aminoácido oxidase e glicolato-oxidase. O segundo, durante a oxidação
aeróbia dos substratos por certas enzimas, tais como xantina oxidase
63
ou
autooxidação de vários compostos com a subseqüente dismutação do
superóxido para H2 O2 , conforme mostrado abaixo 62, 63.
1e
. O2
O2 O2
O2
SOD
H 2 O2 O2
A SOD é conhecida por ser uma das principais defesas enzimáticas
contra os radicais livres. A SOD extra-celular (EC-SOD) é a única forma
extracelular de SOD e está presente em grande concentração na intima do
vaso64. A SOD tem um papel de destaque na manutenção da integridade
celular e na função endotelial, pois promove vasodilatação dependente do
endotélio 52.
A
enzima
antioxidante
SOD
compreende
três
formas:
SOD-
mitocondrial (manganês dependente), a SOD-citoplasmática (dependente de
cobre e zinco ) e a SOD-extracelular (ferro dependente)65. A enzima SOD
catalisa a dismutação do ânion superóxido em oxigênio e H2O2, que pode ser
posteriormente degradado pela catalase ou peroxidase
66
.
19
A catalase, formalmente denominada hidroperoxidase, é uma enzima
intracelular, encontrada na maioria dos organismos, que decompõe H2O2
segundo a reação química:
2 H 2O2
CAT
O2
2 H 2O
O H2 O2 é um produto decorrente do metabolismo celular em
organismos expostos ao oxigénio. Uma das fontes de H2O2, é a β-oxidação
de ácidos graxos, necessária para a produção de diversos metabolitos
essenciais. O H2O2 tem relação direta com diversas patologias ligadas ao
estress oxidativo 67.
A CAT constitui uma defesa inicial contra o estresse oxidativo e está
presente principalmente nos peroxissomas
68
. Alguns órgãos, por não
possuírem peroxissomas estão mais expostos aos danos provocados pela
produção de EROs, como o coração, os pulmões e o cérebro. Nesses
órgãos, um mecanismo de defesa pode ser a difusão do H2O2 para o sangue,
no qual reage com a CAT eritrocitária 69.
Entretanto, há outros mecanismos para tratar o fluxo intracelular de
H2O2 em todos os tecidos. Sugere-se que o maior sistema intracelular de
decomposição de H2O2 é a glutadiona peroxidase (GPx). A família das GPx
removem o H2O2 acoplando sua redução à água com a oxidação da
glutationa reduzida (GSH). A GPx se utiliza de uma variedade de doadores
de elétrons e também de GSH. Esta por sua vez pode ser oxidada, pelo H2O2
formando a glutadiona oxidada (GSSG), removendo-o e formando água
H 2O2
2GSH
GPx
GSSG 2 H 2O
20
A GPx, descoberta em 1957 por Mills, é uma das enzimas que fazem
parte das defesas antioxidantes primárias 70. Ela tem uma ação nãoespecífica sobre o H2O2, atuando sobre vários substratos como os
hidroperóxidos orgânicos. Há dois tipos de GPx: uma utiliza selênio como
cofator, o qual é encontrada tanto na mitocôndria como no citosol; a outra,
uma selênio independente, que se encontra apenas no citosol e metabolisa
exclusivamente hidroperóxidos orgânicos. A GPx catalisa a reação de
hidroperóxidos com a GSH para formar GSSG e o produto de redução do
hidroperóxido. A GPx tem alta afinidade no fígado e nos eritrócitos, moderada
atividade no coração e nos pulmões e baixa atividade no músculo 70.
Fisiologicamente, a GPx atua acoplada à enzima glutationa redutase (GR)
que, por sua vez, catalisa a redução de GSSG, usando NADPH como cofator.
21
1.4.3 Antioxidantes Não Enzimáticos
O contingente de defesa contra agentes pró-oxidantes são as defesas
não enzimáticas. Estas podem ser divididas em antioxidantes GSH,
peptídeos de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina),
ácido diidrolipóico e CoQH2 (Coenzima Q-citocromo c redutase) hidrofílicos
(glutation, vitamina C, indóis, catecóis) e lipólicos (bioflavonas, vitamina A,
vitamina E). Entre os primeiros a vitamina C tem ação como scavenger e
também regeneradora da vitamina E (tocoferol). Como a vitamina C é
hidrossolúvel, possui maior ação no plasma sanguíneo, enquanto a vitam ina
E, lipossolúvel, tem maior ação em membranas celulares. A vitamina C (ácido
ascórbico) tem ação através do ascorbato, que tem propriedade doadora de
elétrons. O ácido úrico também tem ação antioxidante pela capacidade dos
uratos de seqüestrar radicais livres (RLs)71. Os estrógenos também são
considerados antioxidantes pela sua ação como scavenger, inibindo a
oxidação lipídica das LDL.
Já os carotenóides são um grupo de compostos no qual se destacam
os β-carotenos, precursores da vitamina A e o licopeno, que dá a cor
avermelhada ao tomate, melancia, uva, etc. Na circulação, junto com as
lipoproteínas absorvidas na superfície intestinal, os carotenóides agem como
seqüestradores de lipoperóxidos 72.
Entre os antioxidantes não enzimáticos, a glutationa (γ-glutamilcisteinilglicina), que é um tripeptídeo linear (hidrossolúvel) presente em alta
concentração na maioria das células eucariontes (5 a 10 mM) na maioria das
células de mamíferos conhecido como o tiol não protéico mais importante nos
sistemas vivos, protegendo não enzimaticamente as células contra enzimas
22
antioxidantes (EAO) como o O2-, OH• gerados durante o metabolismo aeróbio
e atuando como co-substrato (doador de elétrons) para a enzima GPx na
redução de peró xidos
57
. A maior parte de sua fração é citosólica e ao redor
de 10% do seu conteúdo celular encontra-se dentro das mitocôndrias. De
fato, a capacidade antioxidante da GSH é devida ao grupo sulfidrila (-SH) do
aminoácido cisteína, que se oxida facilmente, atuando como um redutor
celular. O produto dessa oxidação é o dissulfeto (SS) e o GSSG.
Especificamente no coração, a glutationa encontra-se predominantemente
(>95%) na forma de GSH 73.
Alguns estudos sugerem que a depleção de 20 a 30% da
concentração normal de GSH deixa a célula suscetível à ação de radicais
livres Dessa forma, a razão redox, razão entre a GSH e GSSG (GSH/GSSG),
têm sido usadas como um índice de estresse oxidativo, sendo que aumentos
desse índice indicam redução do estresse oxidativo e vice versa74.
23
1.5 DISFUNÇÃO AUTONÔMICA, DOENÇAS CARDIOVASCULARES E
ESTRESSE OXIDATIVO
O início da equivalência nas taxas de eventos cardiovasculares entre
os sexos coincide com o advento da menopausa e conseqüentemente da
privação estrogênica
[t6] Comentário:
Item g do REVISOR
Pág 19, trocar o título do subitem por algo
como “Disfunção autonômica, doenças
cardiovasculares e estresse
oxidativo”, recomeçando o parágrafo pelo
assunto disfunção autonômica. A redação
atual não tem nenhuma ligação
com o que vem sendo desenvolvido nos
parágrafos anteriores.
15
. Considerando que alterações no controle autonômico
cardiovascular podem estar envolvidas no maior risco de eventos
cardiovasculares no climatério, é importante lembrar que a manutenção da
função cardíaca normal é obtida através da regulação neural cardíaca pela
integração da atividade do sistema nervoso simpático e parassimpático. Além
disso, o controle da homeostase cardiovascular é dependente da atuação dos
reflexos originados pelos pressorreceptores arteriais, pelos cardiopulmonares
e por sua integração central 75. Estes reflexos contribuem de forma importante
para que em circunstâncias normais, a pressão arterial (PA) seja mantida em
estreita faixa de variação permitindo a perfusão tecidual adequada. Nas
doenças cardiovasculares, as alterações da atividade nervosa simpática são
bem mais conhecidas e estudadas que as do parassimpático, constituindo as
mais fortes evidências da disfunção autonômica
76
. Entretanto, existe um
consenso de que a função vagal preservada é benéfica na manutenção da
variabilidade da PA, com conseqüente proteção de lesão de órgão alvo
77
.
Uma das formas que vem sendo muito utilizada para avaliar o controle
autonômico é o estudo da Variabilidade da Frequência Cardiaca (VFC) Em
1965, Hon e Lee
observaram
que o sofrimento fetal era precedido por
alterações nos intervalos entre os batimentos cardíacos. Sayers e
[H7] Comentário: Idem Item g
24
colaboradores referiram a existência de ritmos fisiológicos embutidos no
batimento a batimento do sinal da freqüência cardíaca. Em 1970 Ewing
colaboradores e Wolf
79
78
e
e colaboradores, que em 1978 elaboraram testes
para detectar a neuropatia autonômica em pacientes diabéticos a partir do
estudo dos intervalos RR
79
. No entanto, foi Wolf e colaboradores, que em
1978, exibiram pela primeira vez a associação de risco de mortalidade pósinfarto, com a redução da VFC. Em 1981, Akselrod
80
e colaboradores
avaliaram, através da analise espectral as oscilações no intervalo entre
batimentos cardíacos consecutivos (intervalos R-R), assim como oscilações
entre
freqüências cardíacas instantâneas consecutivas.
Os sistemas
simpático (SNS) e parassimpático (SNP) são considerados os principais
mecanismos responsáveis pelo controle da freqüência cardíaca. Os efeitos
do simpático sobre a freqüência cardíaca são muito mais lentos do que os do
parassimpático e a análise linear da VFC pode fornecer índices não invasivos
da modulação autonômica cardíaca na presença de variabilidade do ritimo
cardíaco 81.
As DCV estão associadas à alterações autonômicas que incluem
usualmente diminuição da ativação parassimpática e/ou aumento da
modulação simpática. Vários são os métodos invasivos e não invasivos
utilizados para avaliar a função autonômica, tanto em seres humanos quanto
em animais de experimentação. Entre eles, a medida das catecolaminas, a
microneurografia, a sensibilidade barorreflexa (SBR) e a análise da VFC e da
variabilidade da pressão arterial (VPA) nos domínios do tempo e da
freqüência (análise espectral)
82
. O estresse oxidativo é considerado um dos
25
fatores presentes em grande numero de patologias, e pode desempenhar um
papel mecânicístico na disfunção do barorreflexo
83
.
De fato, um dos marcadores do controle autonômico é o sistema
regulatório da circulação comandado pelo barorreflexo que é também
considerado um preditor no prognóstico na DCV. A privação de estrogênio
induz a disfunção endotelial e insuficiência autonômica aumentando o
estresse oxidativo em mulheres jovens e férteis 16.
É sabido que as substâncias antioxidantes parecem melhorar a SBR
em diferentes espécies. No entanto, o papel do estresse oxidativo na
disfunção autonômica durante a privação de estrogênio, não é bem
compreendido 84.
Em um estudo que avaliou a atividade nervosa autonômica em 20
mulheres durante o ciclo menstrual, tanto na fase folicular como na fase
lútea, observou que o componente de baixa freqüência (LF) era maior e o
componente de alta freqüência (HF) era menor na fase lútea comparada a
fase folicular indicando variações do sistema nervoso associados com
flutuações hormonais
85
.
Estes achados não tem sido unânimes. Em um outro estudo dez
voluntarias saudáveis do sexo feminino com idade média de 24,7 ± 2,4 anos
e peso de 63,8 ± 3,9 kg foram selecionadas. Foi aplicado um questionário
para confirmar o estado geral de saúde. Não eram usuárias de cigarro e ou
medicações regulares e não faziam uso de estrógeno e ou progesterona. Os
ciclos menstruais eram regulares. As dosagens hormonais e a VFC foram
medidos durantes as três fases do ciclo menstrual:fase folicular (dia 3,8 ±
0,5), ovulação (dia 15,8 ± 0,7) e fase luteal (dia 22,1 ± 0,4). Os resultados do
26
estudo demonstraram que houve variações cíclicas nos níveis hormonais
endógenos durante o ciclo menstrual, porém não foram associados com as
alterações no controle autonômico cardíaco, medido pela VFC. A correlação
significativa entre o pico dos níveis de estrogênio na ovulação e das medidas
da VFC pressupõe uma associação cardioprotetora do estrogênio nestas
mulheres saudáveis
86
.
Nas mulheres, a VFC tem sido relacionada individualmente aos
hormônios sexuais endógenos, menopausa, TH e índice de massa corporal
(IMC). Não há, no entanto, relato da avaliação da VFC em todos estes fatores
combinados 87.
27
1.6 A INSUFICIÊNCIA OVARIANA PRIMÁRIA
A insuficiência ovariana primária (IOP), menopausa precoce ou
falência ovariana prematura (FOP) é uma condição caracterizada por
amenorréa, hipoestrogenismo e níveis séricos elevados de gonadotrofinas
em mulheres com idade menor do que 40 anos. Embora frequentemente
interpretados como sinônimos, IOP e menopausa não são equivalentes. A
maioria das mulheres com IOP mantém uma função ovariana intermitente e,
diferente das mulheres em menopausa, podem engravidar
88
[H8] Comentário:
Item i do REVISOR
.
A IOP é uma sub-classe das disfunçôes ovarianas na qual a causa
está dentro do ovário. Na maioria dos casos um mecanismo desconhecido
leva à prematura exaustão do “pool” de folículos promordiais. A IOP pode
também resultar de defeitos genéticos, quimioterapia, radioterapia ou cirurgia.
Na maioria dos pacientes (50-60%) a etiologia não foi identificada
89
. O
principal sintoma é a ausência de ciclos menstruais regulares e o diagnóstico
é confirmado pela detecção de níveis séricos aumentados do hormônio
folículo estimulante (FSH) e reduzidas concentrações de estradiol, sugerindo
um defeito ovariano primário
90
. De fato a IOP tem sido confirmada em
mulheres jovens, pela ausência contínua durante quatro meses da
menstruação (amenorréia), associada com níveis do FSH geralmente acima
de 40UI/L, detectados em duas ocasiões com poucas semanas de intervalo.
Ocorre em mulheres antes dos 40 anos
91,92
. As mulheres jovens com IOP
espontânea podem ter níveis mais baixos de andrógenos, comparadas às
mulheres que menstruam normalmente 93.
Pág 22, item 1.6, linha 5: Reescrever a
frase “A IOP é....” A frase atual contém
erros de definição
28
A classificação correta entre IOP definitivo ou intermitente é
dificultada em virtude da apresentação da irregularidade do ciclo menstrual. A
IOP afeta aproximadamente 1 em cada 10.000 mulheres até 20 anos de
idade, 1 em 1000 mulheres até 30 anos de idade, e 1 em cada 100 mulheres
94
com 40 anos de idade
. O índice de mulheres com IOP que tem
antecedentes familiares variam de 4-31% dos casos. Este percentual pode
ser ainda maior se na família há mulheres com início precoce da menopausa
antes dos 40-45 anos
16,95
. O início preciso da IOP é em muitos casos difícil
de determinar e sua evolução tem um curso flutuante. Os níveis elevados de
gonadotrofinas podem ser seguidos por períodos de retorno à normalidade,
inclusive com ovulação e, em 5 a 10% dos casos, gestação e parto 93, 96, 97.
A idade mediana da última menstruação pode variar de 14 a 39 anos,
e a duração da irregularidade menstrual antes do diagnóstico firmado de IOP
é inferior a 3 anos em 44% da amostra e superior a 9 anos em 16% das
pacientes
98
.
A incidência de IOP em pacientes com cariótipo 46 XX gira em torno
de 1:1000 antes dos 30 anos, 1:250 em torno dos 35 anos e de 1:100 aos 40
anos. A prevalência de IOP em pacientes com amenorréia primária é de 10–
28% e 4–18% com amenorréia secundária 99.
Do ponto de vista clínico, a maioria das mulheres com IOP,
apresentam menarca na idade habitual, ciclos inicialmente regulares e que a
partir de um determinado período tornam-se irregulares, variando de
oligomenorréia
menstruações 100,
a períodos de amenorréia, até a cessação completa das
101
. Estas,inicialmente apresentam sintomas vasomotores
importantes, como fogachos e sudorese, alteração de humor, evoluindo
29
posteriormente para a atrofia do trato urogenital, com maior propensão para
vaginites, cistites e dispareunia 102, 103.
A
reposição
fisiológica
de
hormônios
ovarianos
esteróides
é
geralmente aceita como rotina em mulheres com menopausa (50 anos). No
entanto em mulheres jovens há poucos dados sobre risco e benefício, ou
utilizando-se a TH cíclica como base do tratamento, que deve ser continuada
até a idade da menopausa natural
88
. O princípio do uso de TH em mulheres
jovens difere ligeiramente das mulheres mais velhas, pois estas buscam
como objetivo principal a qualidade de vida e a minimização dos sintomas
típicos desta fase. As mulheres jovens podem necessitar uma dose maior de
estrogênio do que as utilizadas em populações com idades mais
avançadas 104.
[U9] Comentário: Item J
Pág 25, 2º parágrafo, linha 5: A frase
“Nestas mulheres...” não tem sentido.
Reescrever
30
1.6.1. Disfunção Endotelial Nas Mulheres Com IOP
Nas mulheres jovens, com função ovariana normal, a produção de
estradiol varia ciclicamente durante o ciclo menstrual, cujas maiores
concentrações ocorrem na fase pré-ovulatória e as menores durante a
menstruação. Em um estudo com mulheres jovens normais, a Dilatação
Mediada pelo Fluxo (FMD) variou durante o ciclo menstrual conforme os
níveis de estradiol endógeno. Os níveis baixos de estradiol estavam
associados com uma relativa diminuição da FMD 105.
As mulheres jovens com IOP têm deficiência de estrogênio por mais
anos do que naturalmente mulheres na menopausa, resultando em um
aumento significativo de risco para a osteoporose e doença cardiovascular.
Além disso
podem ter um risco maior de morte prematura, por causas
cardiovasculares
106
, podendo aumentar o risco em até duas vezes
comparadas aquelas com uma função ovariana normal 107.
Os
baixos
níveis
de
estrogênio
em
mulheres
jovens,
independentemente da etiologia, podem ter efeitos nocivos sobre a fisiologia
cardiovascular. Um estudo em mulheres pré menopausadas com baixos
níveis de estrógenos devido a hipogonadismo hipotalâmico mostrou um
aumento na incidência de DAC na cinecoronariografia destas mulheres, em
comparação com as mulheres pré menopausadas com função ovariana
normal
108
. Outra condição caracterizada por baixa produção de estrogênio
em mulheres jovens é a amenorréia atlética. A amenorréia atlética é uma
forma de amenorréia que ocorre em atletas do sexo feminino, principalmente
em exercícios de resistência. É causada por uma inibição do eixo hipotálamo-
31
hipófise-ovariano, levando à baixa produção de gonadotrofinas e baixos
níveis
de estrogênio. Transtornos alimentares e osteoporose estão
associados a características na tríade das mulheres atléticas
109
.
Um estudo de caso controle com 16 mulheres saudáveis em idade
fértil com idade média de 27 ± 3 anos, das quais 8 usavam contraceptivos
orais e 8 não utilizavam, investigou a influência dos contraceptivos orais
sobre a função endotelial. As pacientes se submeteram a medidas de
variações do fluxo sanguíneo do antebraço em resposta à infusão intraarterial de acetilcolina, nitroprussiato de sódio, e NG-Monometil-L-arginina. O
resultado da pletismografia mostrou que a
vasodilatação endotélio-
dependente foi semelhante entre as mulheres com e sem contraceptivo oral.
No entanto a produção basal de ON e sua liberação parece ter sido
aumentada pelo uso de contraceptivos orais
110
.
Nas mulheres com IOP, a administração padrão de TH por seis meses
restaura a função endotelial
111
. Na avaliação pela FMD, o fluxo aumentou
acima do dobro (p< 0,005) comparado com o pré-tratamento chegando a
valores normais após seis meses de tratamento. A TH também induziu a
mudança no perfil lipídico, o que pode ter contribuído para a melhoria da
função endotelial. A TH cíclica foi escolhida para ser administrada em
mulheres
com
IOP,
porque
estas
mulheres
podem
ter
gravidez
espontânea112.
Apesar dos dados consistentes obtidos na literatura sobre função e
disfunção endotelial bem como sobre os efeitos da TH nessas variáveis, não
existem informações sobre o controle autonômico cardiovascular nessa
população de mulheres. O reconhecimento de um risco cardiovascular
32
aumentado nesse grupo e a possibilidade de novas informações envolvendo
[U10] Comentário: Item K
o SNA poderiam fornecer subsídios para novas alternativas de manejo
Pág 26, 3º parágrafo, linha 4 e última
linha: Risco de que?
terapêutico e controle deste risco nessas mulheres.
33
1.7 LIÇÕES DOS MODELOS EXPERIMENTAIS
Modelos experimentais são reconstruções da natureza com o
objetivo de permitir o estudo de um dado fenômeno. Amplamente utilizados
na pesquisa biomédica em geral, seu uso tem sido extremamente valorizado
dada a importância dos ensaios pré-clínicos, fundamentais na validação e
segurança na testagem de novas drogas e substâncias.
De fato, o uso de modelos experimentais tem permitido importantes
avanços no diagnóstico e na terapêutica de doenças tais como diabetes e
hipertensão. O advento e a popularização de novas metodologias ao longo
das duas últimas décadas vêm possibilitando um enorme avanço no
conhecimento das bases moleculares de processos biológicos complexos.
Uma das conseqüências imediatas deste processo é a unificação progressiva
dos vários ramos da biologia, permitindo que, atualmente, biologia celular,
bioquímica, genética, fisiologia e fisiopatologia clínica se desenvolvam de
maneira indistinta através de abordagens experimentais fundamentais. Esta
revolução nas ciências básicas está nos permitindo identificar e caracterizar,
do ponto de vista estrutural, sistemas biológicos que até o momento
permaneciam não elucidados.
Em relação ao tema do presente trabalho, o uso da abordagem
experimental da privação dos hormônios ovarianos em ratas fêmeas jovens,
vem permitindo a testagem em laboratório, em período de tempo muito curto,
das conseqüências autonômicas e cardiovasculares bem como os efeitos de
alterações do estresse oxidativo em modelo de ovariectomia bilateral. Além
disso, outras informações sobre mecanismos envolvidos na Regulação da
34
Circulação em diferentes situações fisiopatológicas tem sido obtidas pelo uso
de modelos experimentais.
É interessante notar que em trabalhos do nosso grupo, por exemplo, a
redução do estresse oxidativo e o aumento das enzimas antioxidantes têm
sido correlacionados com melhora em parâmetros cardiovasculares e
autonômicos, como a sensibilidade dos pressorreceptores, em ratos machos
velhos, com insuficiência cardíaca ou hipertensão e em ratos fêmeas
submetidos à privação dos hormônios ovarianos
83, 84, 113, 114
.
Em um modelo experimental de menopausa em ratas, um outro
trabalho recente de nosso laboratório evidenciou que o treinamento físico
aeróbio induziu aumento da capacidade aeróbia, redução do peso corporal,
da PA e da FC de repouso e melhora na sensibilidade dos pressorreceptores
associada à redução no estresse oxidativo e ao aumento nas defesas
antioxidantes no tecido cardíaco
84
. Melhora cardiovascular também foi
observada em camundongas knockout para o receptor LDL-colesterol
ovariectomizadas após treinamento físico
ovariectomizadas
115
ou em ratas diabéticas
116
, sendo que neste último estudo observamos redução da
mortalidade após o período de treinamento físico. Embora o foco desse
trabalho não seja o estudo dos efeitos do treinamento físico, vale lembrar que
a grande maioria dos estudos de nosso grupo em modelos experimentais tem
usado o treinamento como ferramenta de intervenção. E a importância do uso
desses modelos pode, de fato ser confirmada, por recente editorial publicado
na revista Menopause de autoria de Pru em que vários de nossos trabalhos
são citados como fundamento para o uso do exercício na recuperação do
balanço autonômico após ovariectomia em ratas jovens, um modelo de IOP.
[t11] Comentário: Iten l do Revisor:
exclui-se parte do texto, mas justifica-se a
permanência de parte como a nossa
experiencia em fêmeas com falência
ovariana induzida.
35
Muito destes estudos geraram evidências de que existem intervenções
capazes de
induzir
alterações
favoráveis
na
regulação
autonômica
cardiovascular associadas ou não à mudanças no estresse oxidativo, entre
elas o exercício físico
113, 114, 117-120
. Todavia, deve-se considerar que a maior
parte dos trabalhos publicados na literatura com relação aos efeitos
autonômicos do treinamento físico em animais e humanos, assim como todos
os nossos estudos citados acima, foi realizada em amostras do sexo
masculino, ficando a dúvida se o sexo feminino, em situações fisiológicas,
como o climatério, e fisiopatológicas como a IOP apresentariam alterações
cardiovasculares semelhantes às observadas nos machos e se, futuramente,
poderiam responder a intervenções como o tratamento farmacológico
(reposição hormonal) ou não farmacológico (treinamento físico) de forma
semelhante.
Essas evidências parecem reforçar a idéia de que a ovariectomia em
ratas jovens, pode ser considerada como um modelo biológico experimental
de IOP e poderia fornecer informações importantes sobre os efeitos da
privação estrogênica em fase precoce do ciclo vital.
36
2. JUSTIFICATIVA
O estrógeno é considerado um fator cardioprotetor. Em mulheres com
IOP há uma deficiência de estrogênio que iniciada precocemente dura mais
tempo do que naturalmente ocorre em mulheres na menopausa, resultando
em um aumento significativo de risco.
Considerando as informações da literatura que apontam para um risco
aumentado de DCV na mulher com IOP bem como a inexistência de dados
sobre a função autonômica nessas mulheres o que poderia justificar o
aumento de risco cardiovascular, nesse grupo, a proposta do presente
trabalho foi avaliar a função autonômica num grupo de mulheres com
diagnóstico de IOP, mas sob tratamento com TH.
Dessa forma seria possível identificar se existe disfunção autonômica
nessas mulheres assim como já se sabe com relação à disfunção endotelial e
se a TH seria capaz de normalizar essa disfunção. Além disso, o papel do
estresse
oxidativo
sistêmico
nessas
disfunções
poderia
acrescentar
informações dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nessa patologia.
Sendo assim este estudo visa testar a hipótese de que o IOP em
mulheres sob TH está associado à disfunção autonômica, às alterações do
estresse oxidativo sistêmico e disfunção endotelial. Adicionalmente, em
modelo experimental de IOP e com o auxílio do grupo da Universidade São
Judas Tadeu de São Paulo, liderado pela Profª Katia de Angelis, avaliar os
efeitos da ovariectomia bilateral em grupos de fêmeas tratadas ou não com
reposição estrogênica sobre variáveis hemodinâmicas e autonômicas
cardiovasculares e sobre o estresse oxidativo cardíaco.
37
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar em mulheres normais e com diagnóstico de insuficiência
ovariana primária (IOP) sob
terapia de hormonal (TH) as alterações
hemodinâmicas e autonômicas cardiovasculares bem como a função
endotelial e o estresse oxidativo sistêmico.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a pressão arterial (PA), a freqüência
cardíaca(FC) e a
variabilidade da pressão arterial(VPAS) e da variabilidade da
freqüência cardíaca(V FC) em mulheres com IOP sob TH;
2. Quantificar a função endotelial bem como o estresse oxidativo
sistêmico através da medida da vasodilatação mediada pelo fluxo e da
medida da atividade de enzimas anti-oxidantes.em mulheres com IOP
sob TH,
3. Avaliar as funções hemodinâmica, e autonômica bem como o estresse
oxidativo cardíaco em ratas fêmeas ovariectomizadas tratadas ou não
com reposição estrogência.
38
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improves arterial baro- and chemoreflex in control and diabetic rats.
Auton Neurosci 2007; 133(2):115-20.
119. De Angelis K, Wichi RB, Jesus WR, et al. Exercise training changes
autonomic cardiovascular balance in mice. J Appl Physiol 2004;
96(6):2174-8.
120. De Angelis KL, Oliveira AR, Dall'Ago P, et al. Effects of exercise
training on autonomic and myocardial dysfunction in streptozotocindiabetic rats. Braz J Med Biol Res 2000; 33(6):635-41.
53
5. ARTIGO
DISFUNÇÃO AUTONOMICA CARDÍACA NA INSUFICIÊNCIA OVARIANA
PRIMÁRIA
54
DISFUNÇÃO AUTONÔMICA CARDÍACA NA INSUFICIÊNCIA
OVARIANA PRIMÁRIA
Silvia Goldmeier1, Kátia de Angelis2, Karina Rabello Casali1,César Vilodre3Adriane Belló
Klein4, Rodrigo Plentz5, Polimara Spritzer3, Maria Cláudia Irigoyen 1,6
1 Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia (IC/FUC) do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
2. Laboratório do Movimento Humano, Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP
3 Unidade de Endocrinologia Ginecológica da Divisão de Endocrinologia Hospital de
Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Porto Alegre, Brasil.
4 Deparatmento de Fisiologia ,Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
Porto Alegre, Brasil.
5 Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto
Alegre (UFCSPA). Porto Alegre, Brasil.
6 Unidade de Hipertensão(InCor), Escola de Medicina da Universidade de Sao Paulo,
Sao Paulo, Brasil.
Running Head: Disfunção Autonomica em IOP sob TH
Hypertension
Manuscript word count:
Abstract word count:
Number of figures: 2
Corresponding author:
Maria Cláudia Irigoyen, MD, PhD
Hypertension Unit, Heart Institute (InCor)
Av. Dr. Eneas de Carvalho Aguiar, 44 – Subsolo
Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil – 05403-000
Telephone: +55 11 3069 5006 Fax: +55 11 3085 7887
E-mail: [email protected]
[U12] Comentário: Item a do artigo
Prof. Katia incluída como autora.
55
RESUMO
Disfunção Autonômica Cardíaca na Insuficiência Ovariana Primária
Os benefícios da terapia hormonal sobre a função autonômica cardiovascular
em mulheres com IOP ainda são insuficientes.Objetivo: Avaliar, em mulheres normais
e com
IOP, alterações hemodinâmicas e autonômicas cardiovasculares, função
endotelial e estresse oxidativo sistêmico.Método: Um estudo caso (17 mulheres IOP)
e controle (15 mulheres normais) alinhado a uma coorte no qual mulheres foram
submetidas a avaliação da variabilidade do intervalo RR e dos sinais de pressão
arterial durante repouso e após ortostatismo. Ratas submetidos à ovariectomia foram
testadas quanto as conseqüências cardíacas. Resultados: Mulheres com IOP sob TH
(7,25±3,49 anos) houve aumento da pressão arterial média (94 ± 10 vs 86 ± 5 mmHg)
sem alteração da modulação autonômica do vaso e da função endotelial hauvendo
atenuação da sensibilidade do barorreflexo (3,9 ± 1,38 vs 7,15 ±3,62 ms2 /mmHg) e
redução da variabilidade da freqüência cardíaca (2319 ± 1173 vs 3754 ± 1921 ms2).
Nas ratas ovariectomizadas houve um índice maior de lipoperoxidação (7433 ± 1010
vs 6180 ± 289 cps / mg proteína). Conclusão: Enzimas antioxidantes diminuiram no
tecido cardíaco e a TH não restaurou as disfunções hemodinâmicas e autonômicas nos
animais. Terapias alternativas devem ser investigadas pois a TH a longo prazo não
restaurou todos os fatores de risco cardiovasculares
Palavras-chave: Insuficiência Ovariana Primária, Mulheres, Ratas Fêmeas,Sistema
Nervoso Autônomo,Estresse Oxidativo,Hormônios,Endotélio.
[U13] Comentário: Resumo
modificado
Item b do artigo
56
INTRODUÇÃO
Define-se a Falência Ovariana Prematura (FOP), ou Insuficiência Ovariana
Precoce (IOP), como um distúrbio da função ovariana antes dos 40 anos de idade,
caracterizando-se por amenorréia (4 meses ou mais) associada com altos valores de
Hormônio Folículo Estimulante (FSH) 1 . Estima-se que a ocorrência de IOP em idade
reprodutiva seja de 1% em mulheres abaixo de 40 anos e 0,1% em mulheres abaixo de
30 anos 2 .
Mulheres
diagnosticadas
com
IOP
apresentam
risco
cardiovascular
aumentado3, 4 . A terapia de reposição hormonal em mulheres jovens com IOP restaura
a fisiologia normal e pode também ter efeitos benéficos no sistema cardiovascular.
Contudo, a magnitude do risco cardiovascular a longo prazo nestas pacientes
permanece sem solução.
Considera-se a doença cardiovascular (DCV) como a causa principal de morte
prematura no mundo ocidental, comumente se desenvolvendo 10 anos mais tarde em
mulheres do que em homens. Sabe-se que a DCV é associada com alterações,
avaliadas por diferentes métodos, do controle cardiovascular, tais como a redução na
modulação parassimpática e modulação simpática aumentada do coração. Além do
mais, muitas condições de DCV são associadas com o comprometimento do
barorreflexo, o mais importante regulador a curto prazo da pressão arterial (PA). Na
verdade, a medição da variabilidade da freqüência cardíaca(VFC) e da sensibilidade
barorreflexa(SBR) tem sido usada como uma ferramenta que melhor quantifica os
marcadores da disfunção autonômica5 . Além disso, o estresse oxidativo tem sido
relevante na fisiopatologia de um grande número de doenças, exercendo
provavelmente um papel mecanicistico na disfunção barorreflexa. Isto se deve ao fato
[U14] Comentário: Item C do artigo
Manteve-se a definição pois o trabalho foi
submetido a revista hypertension, não
especifica da área.
Lembramos que a maior parte das
referencias citadas fazem a definição de
IOP.
57
das
substancias
antioxidantes
influenciarem
favoravelmente
a sensibilidade
barorreflexa (SBR)6, 7 e a redução do estresse oxidativo ter sido correlacionada com a
melhora deste reflexo em ratas fêmeas8,9 . Neste aspecto, já foi à muito tempo
comprovado que o hormônio feminino, estrogênio, protege contra a DCV, mas o seu
mecanismo de ação ainda é desconhecido. Estudos demostraram que a privação de
hormônios femininos induz à disfunção endotelial, ao comprometimento autonômico
e ao aumento do estresse oxidativo em mulheres jovens em idade fértil, da mesma
forma que em ratas fêmeas submetidas à ovariectomia10,12 .
Considerando-se os dados relatados acima, é razoável hipotetizar que mulheres
com IOP (ou menopausa prematura) apresentam um alto risco de DCV, o que pode
ser atribuído a um inicio precoce de privação dos hormônios ovarianos. Contudo, até
recentemente, poucos estudos avaliaram as consequências cardiovasculares do IOP e
não há informação sobre função autonômica e BRS, nem em relação ao estresse
oxidativo em mulheres diagnosticadas com IOP. Neste estudo testamos a hipótese de
que a IOP em mulheres com terapia de reposição hormonal (TH) está associada com a
atenuação da vasodilatação vascular e a disfunção autonômica cardiovascular,
quantificada pela variabilidade da freqüência cardíaca e sensibilidade do barorreflexo,
e que esses comprometimentos estão relacionados às modificações das enzimas
antioxidantes sistêmicas. Além disso, considerando-se que a TH é a chave do
tratamento13 para as mulheres após a confirmação de diagnóstico de IOP a
possibilidade de que a privação dos hormônios ovarianos possa induzir tais mudanças
e que a TH não possa reverter todas essas deficiências, foi examinada em um modelo
experimental de IOP induzida pela ovariectomia em ratas jovens e adultas submetidas
ou não ao TH. Este modelo experimental também permite o estudo do estresse
oxidativo em tecido cardíaco.
[t15] Comentário: Item C da carta do
REVISOR!!! Modificado!
58
Métodos
Parte I. Avaliações em mulheres com IOP
População do estudo.Trata-se de um estudo caso-controle alinhado em uma coorte.
Dezessete mulheres com diagnóstico de IOP (grupo IOP) e quinze mulheres controle
(grupo C) foram incluídas no estudo. As pacientes IOP que apresentaram amenorréia
foram investigadas na Unidade de Endocrinologia Ginecológica da Divisão de
Endocrinologia do HCPA, Hospital das Clinicas de Porto Alegre e foram
acompanhadas por mais de 7 anos a partir do diagnóstico de IOP. A IOP foi definida
como uma amenorréia secundária antes dos 40 anos de idade, com cariótipo normal
(46XX), altos níveis de gonaodotrofina (FSH > 40 UI/L) em no mínimo 2
determinações consecutivas e insuficiência ovariana hipergonadotrófica resultante de
causas outras que não doenças ovarianas autoimunes, cirurgia, quimioterapia ou
radioterapia . Mulheres incluídas no nosso estudo no grupo IOP mostraram durante o
diagnóstico, como esperado, alto FSH( 53,9 ± 24,15 UI/L) e níveis plasmáticos de
hormônios luteinizantes LH( 27,1 ± 11,2 UI/L) e níveis plasmáticos reduzidos de
estradiol (17,7 ± 14,9 pg/mL) em relação à variação padrão normal14 .
Após o
diagnóstico as pacientes foram submetidas à terapia cíclica de reposição hormonal
(TH) cuja apresentação consistia de estrogênio conjugado (Premarin 0,625 mg) e
progesterona (acetato de medroxiprogesterona 5 mg MPA) de uso contínuo
alcançando níveis plasmáticos maiores que 50 pg/mL. Mulheres controles foram
selecionadas na mesma unidade no qual os casos foram acompanhados. Todas as
mulheres mantiveram ciclos ovulatórios normais e foram usuárias de métodos
contraceptivos. Todas as medidas neste grupo de pacientes foram feitas em uma
semana depois do término das menstruações. Pacientes apresentando diabete melito
[t16] Comentário: Modificado de
acordo com item d do REVISOR.
59
(DM),
hipertensão
(HAS),
hipercolesterolemia,
sobrepeso,
sob
tratamento
farmacológico, fumantes e com abuso de álcool foram excluídas deste estudo. Todas
as mulheres forneceram termo de consentimento por escrito para participar neste
estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa.
Características gerais. Medidas antropométricas incluíram peso corporal, altura,
circunferência da cintura (CC, avaliado ao redor do abdômen acima do osso do
quadril) e índice de massa corporal (IMC, determinado pela razão do peso (Kg) e o
quadrado da altura (m2 ). Amostras de sangue foram coletadas através de uma veia
anticubital para a determinação dos parâmetros hormonais e bioquímicos e também a
quantificação de enzimas antioxidantes. As medidas de PA foram feitas no braço
direito com esfigmomanômetro digital (OMRON 711, Matsuaka, Japão), após um
repouso de no mínimo 5’, com as participantes na posição sentada seguindo as
Diretrizes da Sociedade
Britânica de Hipertensão e da Sociedade Brasileira de
Hipertensão.
Vasodilatação mediada pelo fluxo braquial. A função endotelial não invasiva foi
avaliada usando-se ultrasom da arterial braquial. As análises foram realizadas em
ambiente climatizado (21 – 24ºC) no Instituto de Cardiologia de Rio Grande do Sul/
Fundação Universitária de Cardiologia. O estudo com o ultrasom foi feito usando-se o
EnVisor Series ( Philips Ultrasom – Bothell, WA - EUA), um instrumento eco
Doppler com resolução linear de 7-12 MHz e software para imagem adquirida no
modo bidimensional com Doppler colorido e sinal ECG. As imagens com traçado
eletrocardiográfico simultâneo estão gravadas em DVD. Os erros operacionais foram
minimizados mantendo-se o transdutor e o braço na mesma posição durante os
procedimentos. Um manguito de pressão foi colocado no braço esquerdo e inflado até
50 mm Hg acima da pressão sistólica durante 5’ e imediatamente após o manguito foi
60
removido e as imagens do diametro interno da artéria
braquial e a função
vasodilatadora dependente do endotélio (FMD) foram obtidas. Foi permitido um
intervalo de 10’ para a recuperação do vaso. Depois deste período de recuperação, um
segundo exame de linha de base foi executado. O trinitrato de Glicerol (GTN-0,4 mg;
Nitrostat, Parke-Davis, Morris Plainf, New Jersey, EUA) foi administrado e o terceiro
exame da artéria braquial foi feito de acordo com as diretrizes14.
Avaliação hemodinâmica e autonômica. As medidas hemodinâmicas foram obtidas
usando-se o sinal de pressão arterial obtido por meio de dispositivo Finapres Medical
Systems que, através de um sensor colocado no dedo do paciente avaliava
continuamente a onda de pressão. A conversão do sinal analógico para digital foi
efetuada pelo sistema de aquisição CODAS. (CODAS, 1 kHz frequência de
amostragem; Dataq Instruments, Inc., Akron, OH). Todos os registros foram
realizados em uma sala climatizada. Para testar a modulação autonômica, executou-se
uma manobra de ativação simpática, que provocou uma resposta autonômica no qual
as voluntárias passaram da posição dorsal para a posição ortostática. Os registros
foram realizados com pacientes em repouso por 30 'antes do início da gravação do
sinal: 10' na posição dorsal e 10’ ortostática. A análise no domínio da freqüência da
variabilidade da freqüência cardíaca (VFC) foi realizada com um algoritmo autoregressivo 15,16 no intervalo de pulso (IP) e pressão arterial sistólica (PAS) em
seqüências de extensão n = 200 batimentos, obtidos através da gravação da pressão
arterial. A densidade de potência espectral foi calculada para cada série de segmento
tempo, utilizando softwares específicos. Se a seqüência randomicamente selecionada
incluísse segmentos não evidentes tais como baixa derivação de valor médio ou
mudanças bruscas de variância, a seqüência era descartada e uma nova seleção
randômica era realizada. Neste estudo, três componentes espectrais foram
61
considerados: muito baixa freqüência (MBF), 0-0,04 Hz; baixa freqüência (BF), de
0,04 a 0,15 Hz e alta freqüência (AF) 0,15-0,40 Hz. Os componentes espectrais foram
expressos em termos absolutos (s2 ) e unidades normalizadas (nu). A normalização
consistia em dividir o poder de um determinado componente espectral pelo poder total
multiplicado pela razão de 100. A SBR foi estimada pelo índice alfa, definido como a
raiz quadrada da razão entre as BF em SBR e VFC.
Dosagens bioquímicas. Uma amostra de sangue foi obtida em jejum para as medidas
de sódio (Na), potássio (K), glicose, colesterol total e colesterol de baixa e alta
densidade (HDL e LDL, respectivamente), triglicérides (TG) e quantificação de uréia
e creatinina. As medidas de laboratório foram realizados utilizando-se kits
enzimáticos comerciais automatizados (Roche, Mannheim, GE)
Determinações das enzimas antioxidantes . Após a coleta, as amostras de sangue
venoso heparinizado foram lavadas em uma solução de 9 g / L de cloreto de sódio e
centrifugadas três vezes em 3000 g por 10 min em temperatura ambiente. Os glóbulos
brancos foram descartados por aspiração e os eritrócitos diluídos 1/10 em 1 mM de
ácido acético e 4 mM de sulfato de magnésio, após colocados em um banho de gelo
por 10 min e centrifugadas a 4.200 g por 20 min a 0 º C. O sobrenadante foi utilizado
para os testes de enzimas. A atividade do superóxido dismutase (SOD) foi medida no
sangue pela inibição da taxa de pirogalol em 420nm, conforme descrito anteriormente
por Marklund18 . A atividade da enzima foi relatada como hemoglobina U / mg. A
concentração da catalase (CAT) foi medida através da monitorização da diminuição
na concentração de H2O2 espectrofotometricamente a 240 nm, e os resultados
apresentados como pmol de H2 O2 / mg hemoglobina19 .
[U17] Comentário:
Item d
Essas avaliações foram incluídas como
screening geral.
62
Parte 2. Avaliações em um modelo experimental de ratas com IOP
Grupos e animais. Os experimentos foram realizados em 21 ratas virgens da
raça Wistar (192 ± 4 g) do Biotério da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil,
recebendo dieta padrão de laboratório e água ad libitum. Os animais foram alojados
em gaiolas individuais numa sala com temperatura controlada (22o C), com um ciclo
de 12 horas claro-escuro. Todos os procedimentos cirúrgicos e protocolos utilizados
foram aprovadas pelo Comité de Uso de Animais Experimentais da Universidade São
Judas, São Paulo, Brasil, e foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e
Uso de Animais de Laboratório, do National Institute of Health (NIH) As ratas foram
divididas aleatoriamente em três grupos: sham-controle (S, n = 7), IOP experimental
induzida pela ovariectomia (EIOP, n = 7) e EIOP + terapia com estrogênio (EIOP +
TE, n = 7). A IOP foi induzida experimentalmente pela ovariectomia após 10 semanas
de idade. Neste procedimento os animais foram anestesiados (Ketamina 80 mg / kg +
Xilazina 12 mg / Kg), foi feita uma pequena incisão abdominal , os ovários foram
localizados, a trompa foi seccionada e os ovários foram retirados8, 11, 20 . As ratas sham
controles (grupo S) foram submetidas a um falso procedimento de ovariectomia,
apenas com a realização da incisão e do fechamento da parede após manipulação dos
ovários. Sete dias após a ovariectomia e sob a mesma anestesia, as ratas EIOP+TE
foram submetidas a um implante no subcutaneo de uma pellet que liberava 1,5 mg /
dia 17β-estradiol (Innovative Research of America, Toledo, OH) no período de 8
semanas. Como relatado recentemente, a concentração de 17β-estradiol diminue em
ratas ovariectomizadas e aumenta o17β-estradiol após o implante de uma pellet nestes
animais
11, 12
. Neste estudo, a concentração de estrogênio, medida por imunoensaio,
não foi detectável no grupo EIOP, e a concentração de estrogênio foi semelhante entre
os grupos S e EIOP + ET.
63
Exames cardiovasculares. Nove semanas após a indução da IOP experimental,
dois cateteres preenchidos com solução salina 0.06mL foram implantados na artéria
carótida e na veia jugular (PE-10) de ratas anestesiadas (ketamina 80 mg / kg de
xilazina + 12 mg / kg) para medir diretamente a PA e a administração de drogas . As
ratas receberam ração e água ad libitum e após um dia de colocação do cateter foram
analisadas. As ratas estavam conscientes em suas gaiolas e foi permitida a sua livre
circulação durante os experimentos. O cateter arterial foi conectado a um transdutor
(Pressão Arterial XDCR, Kent Científico, Litchfield, CT), e os sinais PA foram
registrados durante um período de 30 minutos através de um microcomputador
equipado com uma placa de conversor analógico-digital (CODAS, 2 kHz frequência
de amostragem; Dataq Instruments, Inc., Akron, OH). Doses crescentes de fenilefrina
(0,25-32 µg / kg) e nitroprussiato de sódio (0,05-1,6 µg / kg) foram injetadas em bolus
seqüencialmente (0,1 mL) para produzir respostas de PA de 5 a 40 mm Hg. Um
intervalo de 3-5 minutos entre as doses foi necessário para a PA retornar à linha de
base. A SBR foi avaliada por um índice médio, relacionando alterações na frequência
cardíaca (FC) com mudanças na PA média (PAM) após a injeção de fenilefrina ou
nitroprussiato de sódio, permitindo uma análise separada de bradicardia reflexa e
taquicardia reflexa, respectivamente 8, 20 .
Perfil de estresse oxidativo. Após avaliação hemodinâmica, os animais foram
mortos por decapitação, o coração (ventrículos) foi imediatamente removido, lavado
em soro fisiológico, debridado para remover o tecido de gordura e tecido conjuntivo
visível. Este tecido foi colocado em tampão gelado e foi homogeneizado em um ultraTurrax, utilizando 1 g de tecido para 5 mL de 150 mmol / L de cloreto de potássio e
20 nmol/L tampão fosfato, pH 7,4. Os homogeneizados foram centrifugados a 600 g
64
por 10 min a -2ºC. O ensaio de quimioluminescência (QL) foi realizado com um
Espectrometro 1215 de cintilação líquida (LKB Produtor AB, Bromma, Suécia), no
modo sem coincidência à temperatura ambiente (25-27ºC). Os sobrenadantes foram
diluídos em 140 mmol / L de KCl, 20 mmol / L tampão fosfato, pH 7,4, e adicionados
aos tubos de vidro, que foram colocados em frascos de cintilação; 3 mM
hidroperóxido de tert-butil foi adicionado e a QL foi determinada até o máximo nível
de emissão8, 21 . A concentração de CAT foi medida espectrofotometricamente pela
monitoração da diminuição da concentração de H2 O2 ao longo do tempo. Alíquotas
das amostras foram adicionados ao tampão fosfato 50 mM em uma cuba de quartzo.
Após a determinação da linha de base do instrumento, o H2O2 foi adicionado até uma
concentração final de 10 mM em 0,9 ml e a absorção foi medida em 240 nm
8, 18
.A
atividade da SOD foi determinada nos homogeneizados pela medição da inibição da
taxa de formação de adrenocromo autocatalítica em 480 nm em um meio de reação
contendo 1 mM de epinefrina e 50 mM de glicina-NaOH, pH 10.5 8, 18 As proteínas
foram analisadas utilizando o método de Lowry et al22 .
65
Análise estatística.
Os dados são apresentados como média ± DP. Parte 1. Para avaliar a
confiabilidade do estudo buscou-se o cálculo do poder, utilizando α índex com nível
de significância de 5%, com magnitude do efeito observado de 3,25, o poder
resultante foi de 90%para uma amostra total de 32 individuos (16 para cada grupo).
As comparações entre os dois grupos com características gerais, análises bioquímicas,
[t18] Comentário: Item d
Cálculo tamanho da amostra.
função vascular e enzimas antioxidantes foram realizadas por meio de testes t de
Student. Os parâmetros de análise espectral foram analisados usando-se análise de
variância (ANOVA) em medidas repetidas, seguido pelo teste de Student-NewmanKeuls (SKN). Parte 2. ANOVA foi utilizado para comparar os grupos, seguida pelo
teste Student-Newman-Keuls. O nível de significância para todos os testes foi
estabelecido em p <0,05.
RESULTADOS
Parte 1. As avaliações nas mulheres com IOP
A Tabela I mostra as características basais dos grupos de mulheres estudadas.
Não houve diferenças na idade e nas medidas antropométricas entre os grupos. Além
disso, PAS e PAD, avaliadas pelo método auscultatório (esfigmomanômetro), foram
semelhantes entre os grupos C e IOP. Não foram observadas diferenças em jejum dos
níveis séricos de CT, HDL e LDL, TG e glicose, nem em Na, K, Cr,U entre os dois
grupos de mulheres estudadas.
A Tabela 2 mostra a vasodilatação dependente (FMD) e independente
(induzido por GTN) do endotélio nos grupos das mulheres estudadas. Além disso, as
[t19] Comentário: ITEM d DO
REVISOR INSERIR cálculo amostral
66
respostas ON-dependentes) e GTN-induzida foram semelhantes entre os grupos C e
IOP, indicando que ambos os grupos apresentavam vasodilatação arterial normal.
A concentração de CAT foi maior no grupo IOP em comparação com o grupo
C, enquanto que na atividade da SOD não foram observadas alterações (Tabela 3).
O grupo IOP não apresentou alterações em PAS em relação ao grupo C. No
entanto a pressão diastólica e a pressão arterial média (avaliação Finapress) foram
maiores em mulheres com IOP em relação às mulheres C. A FC na posição dorsal ou
após a manobra ortostática foi menor no grupo IOP em relação ao grupo C. Além
disso, ambos os grupos responderam à manobra de ortostatismo, com um aumento da
FC (Tabela 4 ).
A variância total da VFC foi menor em mulheres com IOP na posição dorsal
em relação às mulheres C. Esta redução basal na VFC provavelmente aboliu a
resposta fisiológica de redução à manobra do ortostatismo no grupo IOP, uma vez que
apenas o grupo C respondeu a esta manobra, reduzindo a variância total da VFC
(Tabela 4). O componente LF da VFC embora menor, não foi diferente no grupo IOP
em relação ao grupo C. Além disso, ambos os grupos apresentaram componente LF
aumentado
(valores
normalizados)
e
componente
HF
diminuído
(valores
normalizados e absolutos) na comparação da posição ortostática em relação à dorsal.
Ambos os grupos também mostraram um aumento na razão LF/HF relacionada com o
balanço simpato-vagal cardíaco depois da manobra ortostática. Os grupos estudados
não mostraram diferença estatística na VPAS. Ambos os grupos estudados
responderam similarmente à manobra ortostática, mostrando um aumento na variância
total e no componente LF da VPAS. O índice alfa relacionado com a sensibilidade
espontânea do baroreflexo (SBR) estava reduzido nas mulheres com IOP comparado
com as mulheres controle na posição dorsal. A redução neste índice depois da
67
manobra ortostatica, uma resposta fisiológica previsível, ocorreu somente no grupo
controle(Figura 1).
Parte 2. Avaliações em um modelo experimental em ratas com IOP
Conforme descrito na Tabela 6, as ratas EIOP e as ratas EIOP + TE
apresentaram um maior PAM comparados com as ratas Sham. A FC foi semelhante
entre os grupos. A IOP experimental causou uma diminuição na resposta taquicárdica
provocada pela ativação dos barorreceptores durante as quedas da PA (p <0,001). A
TH não alterou a resposta taquicárdica (p> 0,54). A resposta bradicárdica aos
aumentos da PA foi semelhante entre os grupos Sham, EIOP, EIOP + TE (p> 0,16)
(Figura 2).
A peroxidação lipídica das membranas, avaliada por quimioluminescência
apresentou um aumento após a IOP experimental. Uma redução significativa da
quimioluminescência foi observada em homogeneizados de coração de animais IOP
submetidos à TH, quando comparados com animais EIOP. Estas alterações foram
acompanhadas de mudanças das enzimas antioxidantes neste tecido. As concentrações
de CAT e da atividade da enzima SOD que estavam reduzidas após a indução de IOP,
foram restaurados após a TH (Tabela 6).
DISCUSSÃO
O presente estudo apresenta informações importantes. Mulheres com IOP que
foram acompanhados por mais de 7 anos com tratamento hormonal apresentaram
função endotelial e modulação autonômica vascular (VPAS var LF) normais, sem
nenhuma redução nas enzimas antioxidantes sistêmicas. No entanto, elas mostraram
um aumento na PAM (embora na faixa de normalidade), com a VFC e a SBR
68
reduzidas na posição dorsal após a manobra ortostática. O papel da privação dos
hormônios ovarianos sobre as alterações hemodinâmicas pode ser mais bem entendido
na descrição a seguir. Utilizando-nos de uma abordagem experimental, mostramos
que o aumento da PA e a redução da SBR observados em ratas ovariectomizadas
foram resultantes da privação dos hormônios ovarianos. Essas alterações também
foram associadas a um aumento do estresse oxidativo e à uma diminuição das enzimas
antioxidantes no tecido cardíaco. Confirmando os dados obtidos nas mulheres com
IOP, a terapia estrogênica em ratas ovariectomizadas restaurou o perfil oxidativo
cardíaco, mas não foi capaz de normalizar as disfunções hemodinâmicas e
[t20] Comentário:
Item f
Mudado de acordo!
autonômicas.
Pouco se sabe sobre o efeito da privação de estrógenos sobre o risco
cardiovascular em mulheres jovens com IOP (ou menopausa precoce). Neste aspecto,
é importante destacar que não só a menopausa natural (> 50 anos de idade) como
também a menopausa prematura, incluindo a IOP,
que tem sido associadas à
disfunção endotelial 23,24 , apresentam restauração da função endotelial aos valores de
normalidade após seis meses de terapia de reposição hormonal
25
. Os resultados do
presente estudo estão de acordo com esses previamente descritos, uma vez que as
mulheres com IOP cronicamente tratadas com estrógeno (> 7 anos) apresentaram
vasodilatação (endotélio dependente ou independente) e modulação autonômica
vascular (VPAS var e LF) semelhantes às mulheres saudáveis de mesma idade.
A função vascular normal está relacionada ao estado redox ideal. Nesse
sentido, a disfunção endotelial observada após a privação dos hormônios ovarianos
em mulheres e ratas fêmeas foi associada ao aumento do índice de estresse oxidativo e
/ ou redução de enzimas antioxidantes. No presente estudo, foi observado um aumento
da QL, um índice de lipoperoxidação de membrana, acompanhado por uma redução
[t21] Comentário:
DE acordo com o sugerido!Item f!
69
na concentração de CAT e SOD em homogenatos do coração de ratas IOP.
Além
disso, nossos resultados mostraram que as ratas e mulheres IOP após TH
apresentaram perfil oxidativo semelhante aos seus respectivos controles, incluindo um
aumento na atividade da CAT sistêmica em mulheres IOP. Esse resultado reflete uma
melhora no estado redox, podendo estar associado com um aumento na
biodisponibilidade do óxido nítrico (ON) 26, 27 . Em um estudo anterior do nosso grupo,
demonstramos a diminuição da SOD e inalterção na CAT no miocárdio de ratas após
a ovariectomia28 . Visto que o SOD detoxifica o ânion superóxido que inativa o ON 29 ,
a alta atividade da SOD no miocárdio das ratas com IOP submetidas à TH no presente
estudo pode estar associada ao aumento da biodisponibilidade de ON e,
consequentemente, à melhoria da função endotelial. De fato, um estudo anterior
relatou que um anti-oxidante (N-acetil-L-cisteína) reverteu a disfunção endotelial na
aorta de ratas ovariectomizadas
30
. Hernandez et al.11mostraram que a administração
de estrogênio aumenta a condutância vascular em ratas ovariectomizadas,
relacionando este efeito ao aumento da síntese de ON e / ou prevenção do estresse
oxidativo, melhorando desta forma a função endotelial.
Apesar de a função endotelial estar correlacionada com o desenvolvimento da
aterosclerose e, consequentemente, ao aumento do risco cardiovascular em mulheres
com IOP, outros fatores de risco devem ser considerados neste cenário. A incidência
maior de doenças cardiovasculares nessa população também pode estar relacionada a
alterações na PA e em sua regulação, de forma independente ou, pelo menos, não
relacionada somente à disfunção endotelial. Em ratas e camundongas fêmeas, os
valores da PA após a privação dos hormônios ovarianos foram maiores quando
comparados aos observados no grupo controle de ratas fêmeas saudáveis
32
8, 11, 12, 20, 31,
. Em acordo com esses achados, os valores da PAM apresentaram-se elevados em
70
ratas IOP em relação ao grupo controle. Apesar da TH, o grupo de ratas fêmeas
suplementadas com 17β-estradiol (grupo EIOP + TE) também apresentou valores
aumentados de PA em relação às fêmeas sham controles. Além disso, as mulheres
com IOP submetidas à TH de longo prazo, no presente estudo apresentaram maior
PAM (embora na faixa de normalidade) em relação às mulheres controle. Em
contraste, um estudo anterior havia mostrado também a PA inalterada após a TH de
longo prazo em mulheres33 .
A TH é descrita como uma estratégia para proteger as mulheres da morte
cardíaca, provavelmente por melhoria da atividade vagal33 . De acordo com esta
observação clínica, os dados anteriores de nosso grupo mostraram que ratas
suplementadas com 17 -estradiol tinham um tônus vagal exacerbado quando
comparadas com as ratas controles sedentárias ovariectomizadas, atingindo valores
semelhantes aos das controles fêmeas12 . Estudos experimentais em ratos
demonstraram que a inibição simpática, efetivada por mecanismos pré-sinápticos, é
mais potente em fêmeas do que em machos e que estes mecanismos são atenuados
pela ovariectomia34 . Corroborando esses achados, nós demonstramos previamente que
a privação dos hormônios ovarianos pode induzir uma maior atividade simpática para
o coração em ratas ovariectomizadas quando comparadas a controles. Por outro lado,
a TH foi capaz de diminuir esse tônus simpático em ratas ovariectomizadas tratadas
para valores semelhantes aos obtidos em ratas controles12 . A terapia antioxidante, por
aumentar a biodisponibilidade do ON no nó sinusal pode influenciar o controle
autonômico 34 , prevenindo a disfunção autonômica causada por radicais livres
6
e
melhorando a eficácia da resposta cardíacas 26 . Nesse sentido, os efeitos da TH sobre
as enzimas antioxidantes em animais tratados (CAT e SOD) em homogeneizados de
corações de ratas e nas células do sangue de mulheres) observados no presente
71
estudos podem estar ligados à melhora na modulação do controle autonômico do
coração, como previamente já observado em presença do uso de terapia antioxidante.
Um dos dados clínicos mais importantes obtidos neste estudo foi a demonstração de
que tanto o balanço autonômico como o componente LF da VFC, que representa a
modulação simpática cardíaca, estavam na faixa da normalidade em mulheres IOP
sob TH
em comparação
à mulheres controles. Aceitando-se o fato de que a
hiperatividade simpática é considerada um fator de risco potencial de morte por
doença cardiovascular
5, 35, 36
a normalização desta atividade por TH representa um
importante achado do presente estudo.
No entanto, é importante considerear que tanto a deficiência da SBR como da
VFC tem sido associadas com PA mais altas e com maior gravidade da doença
cardiovascular5 . Assim, a identificação do mecanismo subjacente à redução da SBR
tem importantes implicações clínicas. Um estudo recente que examinou as mudanças
da SBR durante o ciclo menstrual mostrou que há um aumento da SBR em fases de
predomínio de estrogênio, enquanto a progesterona parece antagonizar este efeito
37
.
Hunt et al.34 demonstraram que a longo prazo a TH com estrogênio em mulheres pósmenopausadas tem efeito sobre a regulação cardiovascular, como evidenciado pelo
aumento no ganho do barorreflexo sobre o simpático vascular, que pode não se refletir
na PA basal ou no
ganho do barorreflexo sobre o parassimpático cardíaco. No
presente estudo, nós observamos um aumento na PA e uma redução da taquicardia
reflexa comandada pelo barorreflexo em ratas submetidas à IOP, e essas mudanças
não foram revertidas por terapia com estrogênio. Os resultados do presente estudo
também mostraram que mulheres com IOP submetidas à TH apresentaram PA mais
elevada, disfunção do barorreflexo e redução da VFC em decúbito dorsal e também
após a manobra de estimulação simpática (ortostatismo) quando comparadas às
72
mulheres controles. Estes dados sugerem que a TH de longa duração utilizada tanto
em modelo experimental animal como em mulheres com IOP não foi capaz de
restaurar todas as variáveis associadas ao risco cardiovascular provocado pela
privação dos hormônios ovarianos. Baseado nesses dados, novas terapias alternativas
devem ser investigadas.
LIMITAÇÕES DO ESTUDO
As limitações deste estudo incluem a ausência de randomização e o tempo de
TH que não foi exatamente o mesmo entre as pacientes incluídas. Considerando que a
TH é indicada nas pacientes com diagnóstico de IOP não foi possível obter um grupo
sem tratamento pelo período de seguimento. Dessa forma, optou-se por comparar as
variáveis de interesse com um grupo controle pareado pela idade e outras
característica de inclusão, caracterizando o delineamento como caso controle. Com
essa abordagem, as diferenças obtidas foram significativas e o cálculo do poder do
teste de comparação foi de 90% para a amostra total utilizada.
PERSPECTIVAS
Recentemente, o estudo sobre mortalidade associada à doença cardiovascular,
em um total de 1.091 mulheres com ovariectomia bilateral, e 2.383 mulheres controles
mostrou que as mulheres que se submeteram à ovariectomia bilateral em uma idade
jovem tinham o risco de morte cardiovascular aumentado, especialmente por morte
cardíaca. No entanto, este aumento da mortalidade foi atenuado pelo tratamento
adequado com estrogênio 38 . Esta atenuação da mortalidade pode estar relacionada aos
resultados mostrados em nosso estudo, pois as mulheres com IOP sob terapia
estrogênica apresentaram perfil lipídico, função endotelial, modulação autonômica
[t22] Comentário: DE acordo com item
f!!
73
vascular e enzimas antioxidantes sistêmicas em níveis similares aos das mulheres
saudáveis. No entanto, apesar da redução de mortalidade é possível que essa
população esteja exposta a um risco residual provavelmente relacionado à redução
total da VFC e da SBR, dois importantes fatores de riscos cardiovasculares
observados em nosso estudo5, 35, 36 . Estudos futuros deverão investigar outras terapias
para o controle desses fatores de risco. Recentemente, demonstramos que o
treinamento físico associado ou não à TH pode melhorar a BRS em ratas
ovariectomizadas
8, 12, 20, 31
. No entanto, estudos clínicos futuros devem confirmar
esses resultados experimentais e estabelecer o regime de tratamento mais eficaz para
essa população.
74
Fontes financiadoras
Este estudo foi financiado pelo Projeto Casadinhos Fundação de Amparo à
Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS)/Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior(CAPES)-InCor-USP/IC-FUC, Conselho Nacional de
Pesquisa e Desenvolvimento (CNPQ), Fundo de Apoio do IC/FUC À Ciência e
Cultura (FAPICC) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP-07/57595-5).
75
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78
Legenda das figuras
Figura 1. Exemplos de espectro de potência obtidos pela análise espectral aplicados
em série IP do grupo controle (A) e grupo de IOP (B) em condições repousa (linha
preta) e após a manobra de simpático (condição permanente) (linha cinza).
Figura 2. Sensibilidade do Barorreflexo (A) o índice Alpha dos controles (C) e
grupos de mulheres com insuficiência ovariana primária (IOP), (B) respostas
taquicárdicas e bradicárdicas e alterações da pressão arterial em sham (S),
insuficiência ovariana primária experimental (EIOP) e insuficiência ovariana primária
experimental + terapia de estrogênio + (EIOP+TE) . * P <0,05 vs grupo C ou um
grupo S.p < 0,05 vs condição de repouso no mesmo grupo.
79
Tabela1.Características dos grupos controle(C)e insuficiência ovariana primária(IOP)
C
IOP
Valor P
idade (anos)
38 ± 9
37 ± 9
0.76
IMC (kg/m2 )
26 ± 3
26 ± 5
0.74
CC (cm)
91 ± 7
92 ± 11
0.76
PAS (mmHg)
123 ± 11
122 ± 11
0.78
PAD (mmHg)
80 ± 6
75 ± 9
0.11
Na (mEq/L)
141 ± 3
139 ± 3
0.07
K (mEq/L)
4.3 ± 0.4
4.2 ± 0.5
0.54
87 ± 7
85 ± 8
0.44
Colesterol Total (mg/dL)
187 ± 35
196 ± 31
0.41
LDL (mg/dL)
135 ± 28
129 ± 26
0.66
HDL (mg/dL)
51 ± 9
52 ± 7
0.75
TG (mg/dL)
84 ± 33
82 ± 33
0.83
Uréia (mg dL)
25 ± 3
27 ± 6
0.25
0.59 ± 0.06
0.65 ± 0.10
0.07
Glicose (mg/dL)
Creatinina (mg/dl)
Dados são descritos como medias ± DP. (Teste t de Student). IMC: índice de massa corpórea,
CC:circunferência da cintura, PAS:pressão arterial sistolica, PAD:pressão arterial distólica,
FC:frequêcia cardiaca, Na: sódio, K: potassio, HDL: colesterol de alta densidade, LDL: colesterol de
baixa densidade; TG: triglicerideos.
[t23] Comentário: As figuras e tabelas
a seguir foram colocadas em português!!!
80
Tabela 2. Função vascular arterial em contoles(C) e insuficiência
ovariana primária(IOP)
C
IOP
Valor P
FMD (%)
13.7 ± 5.5
14.2 ± 7.1
0.84
GTN (%)
24.2 ± 8.5
22.1 ± 11.7
0.54
Dados são apresentados como media ± DP. (teste t de Student). FMD: vasodilatação mediada pelo
fluxo, GTN:vasodilatação mediada pelo trinitrato de glicerina.
81
Tabela 3. Enzimas antioxidantes determinados nos eritrócitos de grupos controles
(C)e em insuficiência ovariana primária(IOP).
C
IOP
Valor P
CAT (pmols/mg Hb)
3.15 ± 1.06
6.48 ± 3.55*
0.04
SOD (U/mg Hb)
3.15 ± 0.58
3.06 ± 1.20
0.33
Dados são apresentados como media ±.DP. *p< 0.05 vs. C group (teste t de Sutend). CAT:
concentracão enzima catalase, SOD: atividade da enzima superoxide dismutase, Hb: hemoglobina.
82
Tabela 4. Avaliação hemodinâmica e autonômica em grupos controle (C) e
insuficiência ovariana primária (IOP).
C
IOP
Dorsal
Ortostatismo
Dorsal
Ortostatismo
PAS (mmHg)
125 ± 9
ativo
123
± 11
122 ±12
ativo
121
± 13
PAD (mmHg)
65
5
68
7
72
8*
77
12*
PAM (mmHg)
86
5
87
9
94
10*
96
11*
FC (bpm)
71 ± 8
84 ± 9‡
64 ±10*
76 ±14*‡
3754 ± 1921
1860 ± 1035‡
2319 ± 1173*
1455 ± 766
- fLF (Hz)
0.10 ± 0.03
0.10 ± 0.02
0.09 ± 0.03
0.09 ± 0.03
- LF (ms2 )
844 ± 490
636 ± 542
578 ± 400
420 ± 391
- LF (nu)
43.9 ± 19.9
79.1 ± 13.0‡
39.6 ± 16.9
70.5 ± 20.7‡
- fHF (Hz)
0.27 ± 0.05
0.24 ± 0.04
0.29 ± 0.05
0.29 ± 0.05*
- HF (ms )
857 ± 474
194 ± 170‡
821 ± 803
150 ± 86‡
- HF (nu)
56.1.3 ± 19.1
20.9 ± 13.0‡
60.4 ± 16.9
29.5 ± 20.7‡
- LF/HF
1.3 ± 0.7
5.8 ± 4.2‡
0.8 ± 0.5
4.5 ± 4.0‡
VPAS – var
14.6 ± 5.1
34.3 ± 20.7‡
15.1 ± 5.5
34.8 ± 22.9‡
- LF
(mmHg2 )
(mmHg-2 )HF
21.5 ± 12
95.7 ± 60.4‡
35.9 ± 9.34
74.7 ± 44.6‡
17.0 ± 8.7
16.2 ± 12.1
23.1 ± 17.8
18.1 ± 14.1
Indice
(mmHgα2 )
7.15±3.62
2.87 ± 1.60‡
3.9 ± 1.38*
2.56 ± 3.23
VFC - var (ms2 )
2
Dados estão apresentados como médias DP. * p<0.05 vs. grupo controle C na mesma condição. ‡
p<0.05 vs. posição decúbito dorsal no mesmo grupo. PAM: pressão arterial média, PAD: pressão
arterial diastólica, PAS: pressão arterial sistólica, FC: frequência cardíaca, VFC: variabilidade da
frequência
cardiaca,VPAS: variabilidade da pressão arterial sistólica, var: variância total , f: pico de
ceα (ms/mmHg)
freqüência central, LF: componente de baixa frequência, HF: componente de alta frequência .
(mmHg2 )
83
Tabela 5. Avaliação Hemodinâmica no grupo Sham (S), grupo de ratas experimentais
com insuficiência ovariana primária (EIOP) e grupo de ratas experimentais com
insuficiência ovariana primária mais terapia estrogênica (EIOP+TE) .
S
EIOP
EIOP+ET
P value
PAM(mmHg)
106 ± 4
123 ± 8*
121 ± 9*
0.01
FC (bpm)
358 ± 27
359 ± 31
369 ± 30
0.74
Dados são apresentados como medias
±.DP. *p< 0.05 vs. Grupo S (ANOVA). PAM:
pressão arterial média, FC: frequência cardiaca.
84
Table 6. Perfil do estresse oxidativo em sham (S), ratas experimentais com
insuficiência ovariana primária (EIOP) e ratas experimentais com insuficiência
ovariana primria +terapia estrogênica (EIOP-TE) .
S
EIOP
EIOP+TE
Valor P
QL(cps/mg proteina)
6180 ± 289
7433 ± 1010*
5898 ± 806†
0.005
CAT(pmols/mg proteina)
3.92 ± 0.17
3.10 ± 0.68*
4.32 ± 0.72†
0.034
SOD (USOD/mg proteina)
42 ± 3.24
30 ± 3.50*
47 ± 7.51†
0.0001
Dados são apresentados como medias ± DP. *P< 0.05 vs. Grupo S ; †P<0.05 vs. Grupo EIOP .
(ANOVA). QL: quimioluminescencia CAT: concentração da enzima catalase , SOD: atividade da
enzima superoxido dismutase .
85
Fig.1
86
Fig.2
A
0.025
Grupo C
Grupo IOP
(ms/mmHg)
0.020
0.015
*
‡
B
5
4
3
/ 2
/ 0.010
Resposta Taquicárdica
*
Grupo S
*
GrupoE IOP
Grupo E IOP+TE
1
0
0.005
-1
0
Ortostática
Repouso
-2
Resposta Bradicardica
87
6. ARTICLE
CARDIAC AUTONOMIC DYSFUNCTION IN PRIMARY OVARIAN
INSUFFICIENCY
CARDIAC AUTONOMIC DYSFUNCTION IN PRIMARY OVARIAN
INSUFFICIENCY
Silvia Goldmeier1,Kátia Angellis2, Karina Rabello Casali 1 ,César Vilodre3, Adriane Belló
Klein4, Rodrigo Plentz5, Polimara Spritzer3, Maria Cláudia Irigoyen 1,6
1 Institute of Cardiology/Cardiology Foundation University (IC/FUC).Rio Grande do
sul Porto Alegre, Brazil.
2 Sao Judas Tadeu University, São Paulo, Brazil.
3 Gynecological Endocrinology Unit, Division of Endocrinology, Hospital de Clínicas
de Porto Alegre (HCPA). Porto Alegre, Brazil.
4 Phisiology Department, University Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto
Alegre, Brazil.
5 Department of Physiotherapy, University of Health Sciences of Porto Alegre
(UFCSPA).Porto Alegre,Brazil
6 Hypertension Unit, Heart Institute (InCor), University of Sao Paulo Medical School,
Sao Paulo, Brazil.
Running Head: Autonomic dysfunction in POI under HT
Hypertension
Manuscript word count:
Abstract word count:
Number of figures: 2
Corresponding author:
Maria Cláudia Irigoyen, MD, PhD
Hypertension Unit, Heart Institute (InCor)
Av. Dr. Eneas de Carvalho Aguiar, 44 – Subsolo
Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil – 05403-000
Telephone: +55 11 3069 5006 Fax: +55 11 3085 7887
E-mail: [email protected]
89
Abstract
Cardiac Autonomic Dysfunction In Primary Ovarian Insufficiency
Despite the evidence of the benefits of hormone therapy there is no information about
autonomic function in these women. The aim of this study was to evaluate in normal
and POI women the hemodynamic changes, cardiovascular autonomic, endothelial
function, and systemic oxidative stress.This is a case study (17 women POI) and
control (15 women) nested in a cohort study, in which the variability of interval RR
and arterial pressure signals were evaluated during rest and after standing. Rats was
submitted to ovariectomy to tested cardiac consequences.Women under hormonal
therapy (~7 years) have increased median arterial pressure (94 ±10 vs 86 ±5 mmHg)
and normal endothelial and autonomic modulation of vasculature. without autonomic
modulation of the vessel and endothelial function showed attenuation of baroreflex
sensitivity (3.9 ±1.38 vs 7.15±3.62 ms2 /mmHg) and reduced heart rate variability
(2319±1173 vs 3754±1921 ms2 ). In ovariectomized female rats were accompanied by
an increased lipoperoxidation index (7433 ±1010 vs 6180 ±289 cps/mg protein).
Antioxidant enzymes was decreased at cardiac tissue and the hormone therapy in
animals did not restore hemodynamic and autonomic dysfunctions.
Alternative
therapies must be investigated because hormonal therapy may not restore all
cardiovascular risk factors associated with ovarian hormones deprivation
Key Words: Primary Ovarian Insufficiency, Women, Female rats, Autonomic
Nervous System, Oxidative Stress, Hormones, Endothelium
90
INTRODUCTION
Premature ovarian failure or primary ovarian insufficiency (POI), is defined as
a failure of the ovarian function before the age of 40, characterized by amenorrhea
during four months or more, associated with increased values of follicle stimulating
hormone (FSH)1 Prevalence of POI at reproductive age is estimated as 1% in women
under the age of 40 and 0.1% in women under the age of 30 2 .
Women who experience POI are at increased risk for cardiovascular morbidity
and mortality 3, 4 . Hormone replacement therapy in young women with POI restores
normal physiology and might also have beneficial effects on the cardiovascular
system. However, the magnitude of long-term risk in the patients with cardiovascular
disease remains an unsolved issue.
Cardiovascular disease (CVD), which is the leading cause of premature death
in the Western world, typically develops 10 years later in women than in men. It’s
well known that CVD has been associated with alterations in the cardiovascular
autonomic control, such as reduced parasympathetic modulation and increased
sympathetic modulation of the heart evaluated by different methods. Moreover, many
CVD states have been associated with baroreflex impairment, the most important
short-term regulator of arterial blood pressure (AP). Indeed, the measurement of heart
rate variability and baroreflex sensitivity has been used as a tool to better quantify the
markers of autonomic dysfunction
5
. Additionally, oxidative stress has been
implicated in the pathophysiology of a large number of diseases, and it plays a
possible mechanistic role in baroreflex dysfunction, since antioxidant substances seem
to improve baroreflex sensitivity (BRS)6,
7
correlated with this reflex improvement in rats
and oxidative stress reduction was
8, 9
. In this aspect, it has long been
91
established that the female hormone estrogen protects against CVD, but the
mechanism of action remains unclear. Studies have shown that ovarian hormones
deprivation induces endothelial dysfunction, autonomic impairment and increases
oxidative stress in fertile young women as well as in female rats submitted to
ovariectomy 10-12
Considering these data reported above, it is reasonable to hypothesize that
women with POI (or premature menopause) present an increased risk for CVD, which
might be attributed to the early onset of ovarian hormones deprivation. However, so
far very few studies have assessed the cardiovascular consequences of POI and there
isn’t any information about autonomic dysfunction and baroreflex sensitivity, nor
about the role of oxidative stress in women diagnosed with POI. In this study we have
tested the hypothesis that POI in women under hormone replacement therapy (HT)
might be associated with vascular vasodilatation attenuation and cardiovascular
autonomic dysfunction, quantified by heart rate variability and baroreflex sensitivity.
Furthermore, these impairments must probably be related to changes in systemic
antioxidant enzymes. In addition, considering that HT is the key for the treatment of
women after POI13 diagnosis confirmation the possibility that ovarian hormone
deprivation can induce such changes and that HT cannot reverse all of these
impairments was examined in an experimental model of POI induced by ovariectomy
in young adult rats submitted or not to HT. This experimental model also allows the
study of oxidative stress in cardiac tissue.
92
METHODS
Part 1. Evaluations in POI women
Population of the study. This is a case-control nested in a cohort study.
Seventeen women with POI diagnosis (POI group) and fifteen control women (C
group) were included in this study. The POI patients with amenorrhea were
investigated at the Gynecological Endocrinology, Division of Endocrinology,
Hospital de Clinicas de Porto Alegre and had a more than 7-year follow-up from POI
diagnosis. POI was defined as secondary amenorrhea before the age of 40 years, in
normal female karyotype (46, XX) that showed high gonadotropin levels (FSH > 40
IU/L) in at least two consecutive determinations and hypergonadotropic ovarian
failure resulting from causes other than autoimmune ovarian diseases, surgery,
chemotherapy or radiotherapy. Women included in our study in POI group showed at
the diagnosis, as expected, increased FSH (53,9 ± 24,15 UI/L) and luteinizing
hormone plasmatic levels (LH: 27,1 ± 11,2 .UI/L) and reduced estradiol plasmatic
levels (17,7 ± 14,9 pg/mL) in relation to normal standart range14 . After the diagnosis,
the patients underwent cyclic HT, which consisted of combined estrogen (Premarin
0,625 mg) and progesterone (medroxiprogesterone acetate 5 mg MPA), both of
continuos usage, reaching plasmatic levels no lower than 50 pg/mL. Control women
were selected from the same Ginecological Endocrinology Ambulatory, maintained
normal ovulatory cycles and were users of contraceptive method. All measurements in
this group of patients were performed within one week after the cessation of menses.
Patients presenting diabetes mellitus, hypertension, hipercholesterolmia, obessity and
under pharmacological treatment or cigarette smoking or alcohol abuse were excluded
93
from this study. All women gave written informed consent for participation in this
institutional Cardiology Review Board-approved study.
General characteristics. Anthropometric measurements included body weight, height,
waist circumference (WC, evaluated around the abdomen just above the hip bone) and
body mass index (BMI, by the ratio of weight (Kg) and square height (m2)
determinations. Blood samples were collected by assessing an antecubital vein for
biochemical and hormonal parameters determination, as well as antioxidant enzymes
quantification. AP measurements were performed on the right arm by auscultatory
method (sphygmomanometer, OMRON 711, Matsuaka, Japão), after at least 5
minutes of rest, with participants in sitting position, following the guidelines of the
British Society of Hypertension and of the Brazilian Hypertension Society.
Brachial flow-mediated vasodilation. Noninvasive endothelial function was assessed
using brachial artery ultrasound. Analyses were performed in acclimated room (21 24°C) at the Institute of Cardiology of Porto Alegre. The ultrasound study was
performed using EnVisor Series (Philips Ultrasound - Bothell, WA - USA), an echo
Doppler instrument equipped with a 7-12 MHz resolution linear and software to
image acquired in bi-dimensional mode with color Doppler and ECG signal. The
images, with simultaneous electrocardiography trace, were recorded in DVD. The
operational mistakes were minimized keeping the transducer and arm in the same
position during the procedures. A pressure cuff were placed on the left arm and
inflated up to 50 mmHg above systolic pressure during 5 minutes, immediately, the
cuff was removed and the brachial artery internal diameter images were obtained and
endothelium-dependent vasodilator function. Ten minutes were allowed for vessel
recovery. After this recovery period, a second baseline scan was performed. Glyceryl
trinitrate (0.4mg; Nitrostat, Parke-Davis, Morris Plainf, New Jersey, USA) was
94
administered and the 4th scan of the brachial artery was performed, according to the
guidelines15 .
Hemodynamic and autonomic evaluation. Hemodynamic measurements were
recorded using arterial pressure signal obtained by Finapres Medical Systems devices,
that continuously assess the pressure wave, through a sensor placed on the patient’s
finger. Conversion from analogical to digital signal was performed by CODAS
acquisition system (CODAS, 1-kHz sampling frequency; Dataq Instruments, Inc.,
Akron, OH). All records were performed in a quiet and acclimatization room. To test
the autonomic modulations, it was applied a sympathetic activation maneuver which
elicited an autonomic response when the volunteers passed from supine position to
standing position. Records were performed with patients resting for 30’ prior to the
start of recording the signal: 10’ in supine position and 10’ standing upright.
Frequency domain analysis of heart rate variability (HRV) was performed with an
autoregressive algorithm 16,17 on the interval pulse (IP) and systolic arterial pressure
(SAP) sequences of length n = 200 beats, obtained by arterial pressure records. The
power spectral density was calculated for each stationary time series, using specific
softwares. If the randomly selected sequence included evident non stationarities such
as slow drifting of the mean value or sudden changes of the variance, the sequence
was discarded and a new random selection was performed. In this study, three spectral
components were considered: very low frequency (VLF), from 0 to 0.04 Hz; low
frequency (LF), from 0.04 to 0.15 Hz; and high frequency (HF), from 0.15 to 0.40
Hz. The spectral components were expressed in absolute (s 2 ) and normalized units
(nu). Normalization consisted of dividing the power of a given spectral component by
the total power and multiplying the ratio by 100. Spontaneous baroreflex sensitivity
95
(BRS) was estimated by alpha index, defined as the square root of the ratio between
LF powers in BPV and HRV.
Biochemical Measurements. A fasting blood sample was obtained for sodium (Na),
potassium (K), glucose, total cholesterol, high and low-density cholesterol (HDL and
LDL, respectively), triglycerides (TG), urea and creatinine quantification. Laboratory
measurements were performed using automated enzymatic commercial kits (Roche,
Mannheim, GE).
Antioxidant enzyme determinations. After collection, heparinized venous blood
samples were washed in a solution of 9 g/L sodium chloride and centrifuged three
times at 3000 g for 10 min at room temperature. White cells were discarded by
aspiration and the erythrocytes diluted 1/10 in 1 mM acetic acid and 4 mM
magnesium sulfate, placed in an ice bath for 10 min and centrifuged at 4200 g for 20
min at 0ºC. The supernatant was used for enzymes assays. Superoxide dismutase
(SOD) activity was measured in blood by rate inhibition of pyrogallol auto-oxidation
at 420nm as described previously by Marklund18 .The enzyme activity was reported as
U/mg hemoglobin. Catalase (CAT) concentration was measured by monitoring the
decrease in the hydrogen peroxide concentration spectrophotometrically at 240 nm,
and the results are reported as pmol of hydrogen peroxide/mg hemoglobin 19.
Part 2. Evaluations in a rat experimental model of POI
Animals and Groups. Experiments were performed on 21 female virgin Wistar
rats (192
4 g) from the Animal Shelter of University of Sao Paulo, Sao Paulo,
Brazil, receiving standard laboratory chow and water ad libitum. The animals were
housed in individual cages in a temperature-controlled room (22o C) with a 12-h darklight cycle. All surgical procedures and protocols used were approved by the
96
Experimental Animal Use Committee of the Sao Judas University and were conducted
in accordance with National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals. The rats were randomly assigned to one of three groups: controlsham (S, n=7), experimental POI induced by ovariectomy (EPOI, n=7) and EPOI+
estrogen therapy (EPOI+ET, n=7). POI was experimental induced by ovariectomy at
10 weeks of age. In this procedure the animals were anesthetized (Ketamine 80 mg/kg
+ Xylazin 12 mg/Kg), a small abdominal incision was made, the ovaries were then
located, the oviduct was sectioned, and the ovaries were removed
8, 11, 20
. Control-
sham rats (S group) were submitted to an ovariectomy sham procedure. Seven days
after ovariectomy and under the same anesthesia, the EPOI+ET rats were
subcutaneously implanted with a pellet releasing 1.5 mg/day 17β-estradiol (Innovative
Research of America, Toledo, OH over an 8-week period). As reported recently, the
concentrations of 17β-estradiol decreases in ovariectomized rats and increases after
17β-estradiol pellets implantation in these animals11,
12
.In this study, the estrogen
concentration, measured by immunoassay, was non-detectable in EPOI group, and the
estrogen concentration was similar between S and EPOI+ET groups.
Cardiovascular assessments. Nine weeks after experimental POI induction, 2 catheters
filled with 0.06mL saline were implanted into the carotid artery and jugular vein (PE10) of the anesthetized rats anesthetized (Ketamine 80 mg/kg + Xylazin 12 mg/Kg)
for direct measurements of AP and drug administration, respectively. Rats received
food and water ad libitum and were studied 1 day after catheter placement; the rats
were conscious in their cages and allowed to move freely during the experiments. The
arterial catheter was connected to a transducer (Blood Pressure XDCR, Kent©
Scientific, Litchfield, CT), and AP signals were recorded over a 30-minute period by
a microcomputer equipped with an analog-to-digital converter board (CODAS, 2-kHz
97
sampling frequency; Dataq Instruments, Inc., Akron, OH)
8, 20
.Increasing doses of
phenylephrine (0.25 to 32 µg/kg) and sodium nitroprusside (0.05 to 1.6 µg/kg) were
given as sequential bolus injections (0.1 mL) to produce AP responses ranging from 5
to 40 mm Hg. A 3-5 minute interval between doses was necessary for AP to return to
baseline. BRS was evaluated by a mean index, relating changes in heart rate (HR) to
the changes in mean AP (MAP) after phenylephrine or sodium nitroprusside injection,
allowing a separate analysis of reflex bradycardia and reflex tachycardia, respectively.
8,20
Oxidative stress profile. After hemodynamic evaluations, animals were killed by
decapitation, the heart (ventricles) was immediately removed, rinsed in saline,
trimmed to remove fat tissue and visible connective tissue. This tissue was placed in
ice-cold buffer and was homogenized in an ultra-Turrax blender using 1 g of tissue
for 5 mL of 150 mmol/L potassium chloride and 20 nmol/L phosphate buffer, pH
7.4. The homogenates were centrifuged at 600 g for 10 min at -2o C.
Chemiluminescence (CL) assay was carried out with a LKB Rack Beta Liquid
Scintillation Spectrometer 1215 (LKB Producer AB, Bromma, Sweden) in the outof-coincidence mode at room temperature (25-27o C). The supernatants were diluted
in 140 mmol/L KCl, 20 mmol/L phosphate buffer, pH 7.4, and added to glass tubes,
which were placed in scintillation vials; 3 mM tert-butyl hydroperoxide was added
and CL was determined up to the maximal level of emission
8, 21
CAT concetration
was measured spectrophotometrically by monitoring the decrease in H2 O2
concentration over time. Aliquots of the samples were added to 50 mM phosphate
buffer in a quartz cuvette. After determining the baseline of the instrument, H2 O2
was added to a final concentration of 10 mM in 0.9 ml and absorbance was measured
at 240 nm
8, 18
SOD activity was determined in the homogenates by measuring the
98
inhibition of the rate of autocatalytic adrenochrome formation at 480 nm in a
reaction medium containing 1 mM epinephrine and 50 mM glycine-NaOH(hidróxido
de Sódio), pH 10.58,18 . Proteins were assayed using the method of Lowry et al. 22
Statistical analysis
Data are presented as the mean ± SD. Part 1. To evaluate the reliability of the
study, α index with significance level of 5% and magnitude of the observed effect of
3,25 was used to calculate the power that resulted in 90% to a sample with 32
individuals (16 to each group). Comparisons between the two groups for general
characteristics, biochemical evaluations, vascular function, and antioxidant enzymes
were performed using Student’s t tests. The spectral analysis parameters were
analyzed using variance analysis (ANOVA) in repeated measurements, followed by
Student-Newman-Keuls test (SNK) Part 2. ANOVA was used to compare the groups,
followed by the Student-Newman-Keuls test. The significance level for all tests was
established as P < 0.05.
RESULTS
Part 1. Evaluations in POI women
Table I shows the baseline characteristics of the studied women groups. There
were no differences in age nor in anthropometric measurements between the studied
women groups. Moreover, SBP and DBP, evaluated by sphygmomanometer, were
similar between POI and C groups. There were no differences observed either in the
fasting serum levels of total cholesterol, HDL and LDL cholesterol, triglycerides and
glucose, or in sodium, potassium, creatinine and urea levels between the two studied
women groups.
99
Table 2 shows the endothelium-dependent (FMD) and independent (GTNinduced) vasodilatation in studied women groups. The FMD (NO-dependent) and
GTN-induced (endothelium-independent) responses were similar between C and POI
groups, indicating that both groups had normal arterial vasodilatation.
The CAT concentration was increased in POI group as compared with C
group, while no changes were observed in SOD activity (Table 3).
POI group showed no changes in SAP in relation to C group. However,
diastolic and mean arterial pressure (Finapress evaluation) were increased in POI
women as compared to C women. HR in the supine position or after standing
maneuver was lower in POI group as compared to C group. Moreover, both groups
respond to the standing maneuver with an increase in HR (Table 4).
HRV total variance was lower in POI women in the supine position in relation
to C women. This reduction in HRV impaired the adjustments to the standing
maneuver in POI group, since only the C group responded physiologically to this
maneuver reducing HRV total variance (Table 4). The LF component of HRV was
similar in POI group in comparison to C group. Additionally, both groups presented
increased LF component (normalized values) and decreased HF component (absolute
and normalized values) comparing supine position with standing situation. Both
groups also showed an increase in LF/HF ratio, related to sympatho-vagal cardiac
balance, after the standing maneuver. The studied groups showed no statistical
difference in SAPV at baseline condition. However, both studied groups showed
increased SAPV total variance and LF component after standing. The alpha index,
related to spontaneously baroreflex sensitivity, was reduced in the POI women
compared to C women in the supine condition. The reduction in this index after
100
standing manouver, an expected physiological response, was observed only in C
group.
Part 2. Evaluations in a rat experimental model of POI
As described in Table 6, EPOI and EPOI+ET rats presented higher MAP
compared to S rats. HR was similar among the groups. Experimental POI caused a
decrease in tachycardic response evoked by baroreceptor activation during AP falls
(p<0.001). HT did not change tachycardic response (p>0.54). The bradycardic
response to AP rises was similar among S, EPOI, EPOI+ET groups (p>0.16) (Figure
2).
Membrane lipid peroxidation as assessed by chemiluminescence has shown
an increase after experimental POI. A significant reduction was observed in CL heart
homogenates from POI animals undergoing HT, when compared to EPOI animals.
These changes were accompanied by significant alterations in antioxidant enzymes in
this tissue. The CAT concentrations and the SOD enzyme activity were reduced after
POI and were restored with HT (Table 6).
DISCUSSION
There are important insights in the present study. Women with POI who were
followed up for more than 7 years with hormone therapy presented normal endothelial
function and vascular autonomic modulation (LF var SPV) with no reduction in the
systemic antioxidant enzymes. However, they showed increased MAP (although in
normality range), impaired HRV and BRS at supine position, reinforcing the role of
ovarian hormone deprivation on hemodynamic changrs. By using an experimental
approach, it was shown that the AP increase and the BRS impairment observed in
POI-induced rats were induced by ovariectomy. These alterations were also associated
101
with an increase in oxidative stress and a decrease in antioxidant enzymes in cardiac
tissue. By confirming the data obtained from POI women, the use of estrogen therapy
in ovariectomized rats could restore the cardiac oxidative profile, but was not able to
normalize hemodynamic and autonomic dysfunctions.
Little is known about the effect of estrogen deprivation on cardiovascular risk in
young women with POI (or premature menopause). In this aspect, it is important to
highlight that natural menopause (>50 years of age) is associated with endothelial
dysfunction23,24 . POI has also been associated with significant endothelial
dysfunction, which is already restored after six months of cyclical hormone
replacement therapy
25
. The results of the present study are in accordance to those
previously described, in which women chronically treated with estrogen (> 7 years)
presented similar vasodilation (endothelium dependent or independent) and vascular
autonomic modulation (SAPV var and LF), comparable to healthy women at the same
age.
The normal vascular function is related to optimal redox state. In this sense,
the endothelial dysfunction observed after ovarian hormones deprivation in women
and female rats has been associated to increased oxidative stress indexes and/or
reduction in antioxidant enzymes. In the present study it has been observed an
increased CL, an index of membrane lipoperoxidation, accompanied by a reduction in
CAT concentration and SOD activity in heart homogenates of POI rats. Additionally,
our results have shown that POI rats and women following HT presented similar
oxidative profile as compared with their respective controls, including an
enhancement in systemic CAT concentration in POI women, which can represent an
improvement in the redox state that may be associated with increases in nitric oxide
(NO) bioavailability
26, 27
. In a previous study of our group, it was demonstrated
102
reduced SOD and unchanged CAT after ovariectomy in myocardium of female rats 28 .
Since SOD detoxifies the superoxide anion, which inactivates NO
29
, the increased
myocardium SOD activity in POI rats undergoing HT in the present study may be
associated with an increased NO bioavailability and consequently improvement in
endothelial function. In fact, a previous study has reported that a free radical
scavenger (N-acetyl-L-cysteine) reverted endothelial dysfunction in the aortic rings of
ovariectomized rats30 . Hernandez et al11 showed that estrogen administration increases
vascular conductance in ovariectomized rats, relating this effect to an increase in NO
synthesis and/or oxidative stress prevention, thus improving endothelial function.
Despite endothelial function was correlated to atherosclerosis development and
consequently increased cardiovascular risk in POI women, other risk factors must be
considered in this scenario. The enhanced incidence of CVD in this population can
also be related to changes in AP and its regulation, independently or, at least, not only
related to endothelial dysfunction. In rats and mice, AP values after ovarian hormones
deprivation were higher when compared to that observed in healthy control female
rats
8, 11, 12, 20, 31, 32
. Corroborating those findings, we showed elevated MAP values in
rats submitted to POI in relation to sham group. Despite the HT, the female rat group
supplemented with 17β-estradiol (EPOI+ET group) also presented increased AP
values as compared to sham females controls. Furthermore, the women with POI
undergoing long term HT, in the present study presented higher MAP (although in the
normality range) in relation to control women. In contrast, a previous study had also
shown unchanged AP after long term HT in women3 3.
HT has been described as a strategy to protect females from cardiac death
probably by improving vagal activity 33 . In accordance with this clinical observation,
previous data of our group has shown that rats supplemented with 17 -estradiol had
103
an exacerbated vagal tonus when compared to sedentary ovariectomized control rats,
reaching values similar to control females12 . Experimental studies in rats have
demonstrated that the sympathetic inhibition, by presynaptic control mechanisms, is
more potent in females than males and these mechanisms are attenuated by
ovariectomy34 .Corroborating those findings, we have previously shown that ovarian
hormones deprivation induced a higher sympathetic activity to the heart as compared
to control rats. On the other hand, HT was able to decrease this sympathetic tonus in
treated ovariectomized rats, reaching cardiac sympathetic tonus similar to control
female rats12 . Antioxidant therapy by increasing the bioavailability of NO in sinus
node may influence the autonomic control34 reverting the autonomic dysfunction
caused by free radicals6 and improving the effectiveness of cardiac response26 . In this
sense, the HT- induced effects on antioxidant enzymes observed in this study (SOD
and CAT in rat homogenates hearts and in women blood cells) could be related to the
improvement in cardiac autonomic control/modulation as previously observed by
using antioxidant therapy.
Importantly, clinical data of the present study
demonstrated normal autonomic balance and no changes in LF component of HRV,
representative of cardiac sympathetic modulation, in POI women under HT as
compared to control women.
Taking into account the fact that sympathetic
hyperactivity has been considered a potential risk factor to cardiovascular disease and
death5, 35, 36 the normalization of this activity by HT represents an important finding of
the present study.
However, it is important to consider the fact that the impairment in BRS and in
HRV is associated with both higher AP and severity of CVD
5
. Thus, the
identification of mechanism underlying depressed BRS has important clinical
implications. A recent study has examined the changes of BRS during the menstrual
104
cycle and reported an increase of BRS in phases of estrogen preponderance, whereas
progesterone seemed to antagonize this effect.37 Hunt et al. 34 demonstrated that long
term estrogen replacement therapy in postmenopausal women has effects on
cardiovascular regulation, as evidenced by an increase in vascular sympathetic
baroreflex gain, that may be not reflected in resting AP or in cardio-vagal baroreflex
gain. We observed increased AP and reduced tachycardiac response evoked by
baroreflex in female rats submitted to POI in the present study, and these changes
were not reverted by estrogen therapy. Importantly, the results of the present study
also showed that women with POI submitted to HT presented higher AP, baroreflex
dysfunction and reduced total HRV in the supine position and also after the a
sympathetic activation maneuver (standing) in relation to control women. These data
suggest that long-term HT used in both experimental animal models and women with
POI was not able to restore all variables associated to cardiovascular risk provoked by
the deprivation of ovarian hormones. Based on these data, alternative therapies must
be investigated.
105
LIMITATIONS OF THE STUDY
The limitations of this study include lack of randomization and time of HT
which was not exactly the same among patients. Because HT is indicated for patients
with POI, it was not possible to form a group of non-treated individuals at the followup period. Therefore, we chose to compare the variables of interest with a control
group matching age and other characteristics of inclusion, defining the design as the
control case. Taking into account this approach, the differences obtained were
significant and the calculation of the power of the comparison test was 90% for the
total sample used.
PERSPECTIVES
Recently, the study of mortality associated with cardiovascular disease in a
total of 1,091 women with bilateral ovariectomy and 2,383 control women have
shown that women who underwent bilateral ovariectomy at a young age had an
increased cardiovascular death risk, particularly by cardiac death. However, this
increase in mortality was mitigated by appropriate treatment with estrogen 38. This
attenuation in mortality may be related to the results shown in our study because
women with POI under estrogen therapy had lipid profile, endothelial function,
vascular and autonomic modulation, and systemic antioxidant enzymes in similar
levels to those of healthy women. Nevertheless, despite the reduction of mortality, it
is possible that this population is exposed to residual risk most likely related to the
total reduction of HRV and BRS, two major cardiovascular risk factors observed in
our study5, 35, 36 . Future studies should investigate other therapies to control these risk
factors. Recently, we demonstrated that physical training associated or not with HT
may improve BRS in ovariectomized rats
8, 12, 20, 31
. However, future clinical studies
106
should confirm these experimental results as well as establish the most effective
treatment for this population
SOURCES OF FUNDING
This study was supported by Projeto Casadinhos Fundação de Amparo a
Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS)/ Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - InCor-USP/ICFUC, Conselho
Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), Fundo de Apoio do IC/FUC
À Ciência e Cultura (FAPICC) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo (FAPESP- 07/57595-5). K.R.C. held a postdoctoral scholarship
from CAPES. K.D.A., P.Z., and MCI are recipients of CNPq-BPQ fellowships.
The author(s) declare that they have no conflict of interest
.
107
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110
Figures Captions
Figure 1. Examples of power spectrum obtained by spectral analysis, applied to IP
series of control group (A) and POI group (B) in supine condition (black line) and
after sympathetic maneuver (standing condition) (grey line).
Figure 2. Baroreflex sensitivity. (A) Alpha index in control (C) and primary ovarian
insufficiency (POI) women groups. (B) Tachycardic and bradycardic responses to
arterial pressure changes in sham (S), experimental primary ovarian insufficiency
(EPOI) and experimental primary ovarian insufficiency +estrogen therapy (EPOI-ET)
rats. * p<0.05 vs. C group or S group. ‡ p<0.05 vs. supine condition in the same
group.
111
Table 1. Characteristics of control (C) and primary ovarian insufficiency POI) groups.
C
POI
P value
Age (years)
38 ± 9
37 ± 9
0.76
BMI (kg/m2 )
26 ± 3
26 ± 5
0.74
WC (cm)
91 ± 7
92 ± 11
0.76
SBP (mmHg)
123 ± 11
122 ± 11
0.78
DBP (mmHg)
80 ± 6
75 ± 9
0.11
Na (mEq/L)
141 ± 3
139 ± 3
0.07
K (mEq/L)
4.3 ± 0.4
4.2 ± 0.5
0.54
87 ± 7
85 ± 8
0.44
Total Cholesterol (mg/dl)
187 ± 35
196 ± 31
0.41
LDL (mg/dl)
135 ± 28
129 ± 26
0.66
HDL (mg/dl)
51 ± 9
52 ± 7
0.75
TG (mg/dl)
84 ± 33
82 ± 33
0.83
Urea (mg dl)
25 ± 3
27 ± 6
0.25
0.59 ± 0.06
0.65 ± 0.10
0.07
Glucose (mg/ml)
Creatinine (mg/dl)
Data are reported as means ± S.D. (Student t test). BMI: body mass index, WC: waist circumference,
SBP: systolic blood pressure, DBP: diastolic blood pressure, HR: heart rate, Na: sodium, K: potassium,
HDL: high density cholesterol, LDL: low density cholesterol; TG: triglycerides.
112
Table 2. Arterial vascular function in control (C) and ovarian insufficiency (POI)
groups.
C
POI
Valor P
FMD (%)
13.7 ± 5.5
14.2 ± 7.1
0.84
GTN (%)
24.2 ± 8.5
22.1 ± 11.7
0.54
Data are reported as means ± S.D. (Student t test). FMD: flow-mediated dilatation, GTN: glyceryl
trinitrate mediated vasodilatation.
113
Table 3. Antioxidant enzymes determinations in erythrocytes of control (C) and
primary ovarian insufficiency (POI) groups.
C
POI
P value
CAT ( pmols/mg Hb)
3.15 ± 1.06
6.48 ± 3.55*
0.04
SOD (U/mg Hb)
3.15 ± 0.58
3.06 ± 1.20
0.33
Data are reported as means ± S.D. *p< 0.05 vs. C group (Student t test). CAT: catalase enzyme
concentration, SOD: superoxide dismutase enzyme activity, Hb: hemoglobin.
114
Table 4. Hemodynamic and autonomic evaluations in control (C) and primary
ovarian insufficiency (POI) groups.
C
POI
Supine
Standing
Supine
Standing
SAP (mmHg)
125 ± 9
123 ± 11
122 ±12
121 ± 13
DAP (mmHg)
65
5
68
7
72
8*
77
12*
MAP (mmHg)
86
5
87
9
94
10*
96
11*
HR (bpm)
71 ± 8
84 ± 9‡
64 ±1*
76 ±14*‡
3754 ± 1921
1860 ± 1035‡
2319 ± 1173*
1455 ± 766
- fLF (Hz)
0.10 ± 0.03
0.10 ± 0.02
0.09 ± 0.03
0.09 ± 0.03
2
- LF (ms )
844 ± 490
636 ± 542
578 ± 400
420 ± 391
- %LF (nu)
43.9 ± 19.9
79.1 ± 13.0‡
39.6 ± 16.9
70.5 ± 20.7‡
- fHF (Hz)
0.27 ± 0.05
0.24 ± 0.04
0.29 ± 0.05
0.29 ± 0.05*
- HF (ms2 )
857 ± 474
194 ± 170‡
821 ± 803
150 ± 86‡
- %HF (nu)
56.1.3 ± 19.1
20.9 ± 13.0‡
60.4 ± 16.9
29.5 ± 20.7‡
1.3 ± 0.7
5.8 ± 4.2‡
0.8 ± 0.5
4.5 ± 4.0‡
SAPV – var
14.6 ± 5.1
34.3 ± 20.7‡
15.1 ± 5.5
34.8 ± 22.9‡
(mmHg-2 )LF
(mmHg-2 )HF
21.5 ± 12
95.7 ± 60.4‡
35.9 ± 9.34
74.7 ± 44.6‡
17.0 ± 8.7
16.2 ± 12.1
23.1 ± 17.8
18.1 ± 14.1
7.15±3.62
2.87 ± 1.60‡
3.9 ± 1.38*
2.56 ± 3.23
2
HRV - var (ms )
- LF/HF
α
Index2 )(ms/mmHg)
(mmHg
Data are 2reported as means SD. * p<0.05 vs. C group in the same condition. ‡ p<0.05 vs. supine
(mmHg
condition )in the same group. MAP: mean arterial pressure, DAP: diastolic arterial pressure, SAP:
systolic arterial pressure, HR: heart rate, HRV: heart rate variability, SAPV: systolic arterial pressure
variability, var: total variance, f: spectrum frequency, LF: low frequency component, HF: high
frequency component.
115
Table 5. Hemodynamic evaluations in sham (S), experimental primary ovarian
insufficiency (EPOI) and experimental primary ovarian insufficiency +estrogen
therapy (EPOI-ET) rats.
S
EPOI
EPOI+ET
P value
PAM (mmHg)
106 ± 4
123 ± 8*
121 ± 9*
0.01
HR (bpm)
358 ± 27
359 ± 31
369 ± 30
0.74
Data are reported as means ± S.D. *p< 0.05 vs. S group ( ANOVA). PAM: mean arterial pressure, HR:
heart rate.
116
Table 6. Oxidative stress profile in sham (S), experimental primary ovarian
insufficiency (EPOI) and experimental primary ovarian insufficiency +estrogen
therapy (EPOI-ET) rats.
S
EPOI
EPOI+ET
P value
CL (cps/mg protein)
6180 ± 289
7433 ± 1010*
5898 ± 806†
0.005
CAT (pmols/mg protein)
3.92 ± 0.17
3.10 ± 0.68*
4.32 ± 0.72†
0.034
SOD (USOD/mg protein)
42 ± 3.24
30 ± 3.50*
47 ± 7.51†
0.0001
Data are reported as means ± S.D. *P< 0.05 vs. S group; †P<0.05 vs. EPOI group. (One Way
ANOVA). CL: chemiluminescence; CAT: catalase enzyme concentration, SOD: superoxide dismutase
enzyme activity.
117
Fig.1
118
Fig.2
A
0.025
C group
POI group
(ms/mmHg)
0.020
0.015
*
‡
B
5
4
3
Tachycardic Responses
*
S group
*
EPOI group
EPOI+ETgroup
/ 2
0.010
1
0
0.005
-1
0
Supine
Standing
-2
Bradycardic Responses