Free T3 - Meditecno

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Free T3 - Meditecno

Free T3
®
Coat-A-Count Free T3
English
Intended Use: Coat-A-Count Free T3 is a
125
solid-phase I radioimmunoassay
designed for the quantitative
measurement of free T3 levels in serum. It
is intended strictly for in vitro diagnostic
use as an aid in the clinical assessment of
thyroid status.
Catalog Numbers: TKF31 (100 tubes)
The 100-tube kit contains less
than 4.5 microcuries
(167 kilobecquerels) of
125
radioactive I-T3 analog.
Summary and Explanation
Under normal physiological conditions
triiodothyronine (T3) represents
approximately 5 percent of the thyroid
hormone in plasma. Although present in
lower concentration than thyroxine (T4),
T3 has greater metabolic activity, faster
turnover and a larger volume of
distribution. It is produced largely through
extrathyroidal conversion of T4. Like T4, it
circulates almost entirely bound to the
carrier proteins TBG, pre-albumin and
albumin. Free T3 constitutes only about
0.25% of the total T3 in circulation.
Measurement of total T3 by immunoassay
has a number of well-established uses. It
is often employed to help confirm a
diagnosis of hyperthyroidism where an
elevated free or total T4 has been
encountered. Abnormal elevations in total
T3 may also occur in the context of a
normal total T4 — a condition known as
"T3 toxicosis."
For the most part, free T3 levels correlate
closely with total T3 levels. Total T3,
however, is a function not only of thyroid
status and the peripheral conversion of T4
to T3, but also of the concentration of
thyroid hormone-binding proteins. Free
T3, on the other hand, is largely
unaffected by variations in these carrier
proteins. Thus, the TBG elevations typical
of pregnancy, oral contraceptives and
estrogen therapy will induce an increase in
the total T3 level while leaving the free T3
concentration basically unchanged.
2
Typically, the free T3 concentrations will
reflect the patients' actual thyroid status
more reliably than the total T3
concentrations.
Principle of the Procedure
The Coat-A-Count Free T3 procedure is a
solid-phase radioimmunoassay, wherein
125
I-labeled T3 analog competes for a fixed
time with free T3 in the patient sample for
sites on T3-specific antibody. Because the
antibody is immobilized to the wall of a
polypropylene tube, simply decanting the
supernatant suffices to terminate the
competition and to isolate the
antibody-bound fraction of the
radiolabeled free T3. Counting the tube in
a gamma counter then yields a number,
which is inversely related to the
concentration of free T3 present in the
patient sample.
The Coat-A-Count Free T3 procedure is a
9
direct or single tube assay, in the limited
sense that its results are not calculated as
a function of total T3, but interpolated from
a calibration curve calibrated in free T3
concentrations. In this respect it differs
from classic equilibrium dialysis methods
and from so-called free T3 Index
determinations as well. It is also a
single stage assay, requiring neither a preincubation step nor preliminary isolation of
the free fraction by dialysis or column
chromatography.
The Coat-A-Count Free T3 system has
been optimized to eliminate all binding of
the T3 analog tracer to endogenous
proteins, while leaving essentially
undisturbed the original equilibrium
between free and protein-bound T3 in the
patient sample. The tracer itself has no
measurable affinity for thyroid-binding
globulin (TBG), the principal thyroid
hormone transport protein. To prevent
binding of the tracer to albumin, blocking
agents are present, at a concentration
carefully adjusted to avoid displacement of
native T3 from endogenous carrier
proteins. To further minimize the risk of
"stripping," the system employs an
antibody, at low concentration, with an
affinity for T3 slightly less than that of
TBG, and operates under physiological
Coat-A-Count Free T3 (PITKF3-8, 2010-10-22)
conditions of temperature, pH and ionic
strength.
No Albumin-Related Artifacts: Siemens
Healthcare Diagnostics analog-method
free T3 system is distinguished by its use
of an effective, appropriately optimized
concentration of albumin-blocking agents.
This eliminates the artifacts so often seen
with other commercially available analog
methods in connection with third-trimester
pregnancy, nonthyroidal illness and
heparin therapy — conditions involving
abnormal levels of albumin and/or free
fatty acids. (For a full discussion of this
issue, see the articles by Witherspoon, El
24
Shami, et al. Background information
can be found in the monograph AlbuminRelated Artifacts in Free Thyroid Hormone
Assays, available from Siemens
Healthcare Diagnostics.)
Expected Values: The recommended
reference range of 1.4–4.4 pg/mL
(2.2–6.8 pmol/L) is in substantial
agreement with modern reference
methods, viz. direct radioimmunoassays
for free T3 in serum dialysates. The
Coat-A-Count Free T3 kit's ability to
discriminate between hyperthyroid
samples and euthyroid controls has been
extensively tested on clinically confirmed
samples. Its accuracy has been further
verified on pregnancy samples and
samples from patients with nonthyroidal
illness.
Reagents to Pipet: 1
Total Incubation Time: 3 hours at 37°C
Total Counts at Iodination:
approximately 60,000 cpm
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
Water: Use distilled or deionized water.
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals — and strictly
for in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
3
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Materials Supplied:
Initial Preparation
Note that materials supplied in this kit are
not interchangeable with those in Coat-ACount Total T3 kit.
Free T3 Ab-Coated Tubes (TF31)
Polypropylene tubes coated with
antibodies to triiodothyronine (T3) and
packaged in zip-lock plastic bags. Store
refrigerated and protected from moisture,
carefully resealing the bags after opening.
Stable at 2–8°C until the expiration date
marked on the bag. Color: aquamarine.
TKF31: 100 tubes.
125
I Free T3 (TF32)
Lyophilized tracer, consisting of iodinated
T3 analog. Reconstitute each vial by
adding a measured 110 mL distilled or
deionized water. Let stand for 10 minutes,
then mix by gentle inversion. Stable at
2–8°C for 30 days after reconstitution, or
until the expiration date marked on the
vial.
TKF31: 1 vial.
Free T3 Calibrators (F3C3–9)
Seven vials of lyophilized processed
human serum, labeled A through G. At
least 30 minutes before use, reconstitute
the zero calibrator A with 2.0 mL distilled
or deionized water, and each of the
remaining calibrators B through G with
1.0 mL distilled or deionized water. Use
volumetric pipets and mix by gentle
swirling. Stable at 2–8°C for 30 days after
reconstitution.
TKF31: 1 set.
4
The reconstituted calibrators have
lot-specific free T3 values of
approximately 0, 0.5, 1.6, 3.5, 7.0, 21 and
42 picograms of free T3 per milliliter
(pg/mL); equivalently: approximately 0,
0.77, 2.5, 5.4, 11, 32 and 65 picomoles
per liter (pmol/L). Refer to the vial labels
for exact values in pg/mL. To convert to
pmol/L, multiply by 1.536.
Materials Required But Not
Provided
Gamma counter — compatible with
standard 12x75 mm tubes
Vortex mixer
Reagent Preparation
Graduated cylinder: 110 mL
Volumetric pipets: 1.0 and 2.0 mL
Distilled or deionized water
Radioimmunoassay
Plain 12×75 mm polypropylene tubes —
for use as NSB tubes, available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: PPO).
Micropipets: 100 µL and 1,000 µL
Waterbath — capable of maintaining
37°C. Neither a heat block nor an oven is
suitable.
Foam decanting rack — available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR).
Logit-log graph paper
Controls. A tri-level, human serum-based
immunoassay control, containing free T3
as one of over 25 assayed constituents, is
available from Siemens Healthcare
Diagnostics (catalog number: CON6).
Specimen Collection
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
25
Collect blood by venipuncture into plain
tubes, and separate the serum from the
cells by centrifugation.
Heparin has been reported to have both in
vivo and in vitro effects on free thyroid
8
hormones. Hence, samples should not be
collected during or soon after the
administration of this anticoagulant.
Lipemic, icteric or grossly contaminated
samples may give erroneous results. The
use of an ultracentrifuge is recommended
to clear lipemic samples.
Calibrators
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. Coat-ACount Free T3 has not been tested with all
possible variations of tube types. Consult
the section on Alternate Sample Types for
details on tubes that have been tested.
Volume Required: 100 µL of serum per
tube.
2
Before assay, allow the samples to come
to room temperature (15–28°C) and mix
by gentle swirling or inversion. Aliquot, if
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. Do not attempt to thaw frozen
specimens by heating them in a
waterbath.
All components must be at room
temperature (15–28°C) before use.
0
0
B
0.5
0.77
C
1.6
2.5
D
3.5
5.4
E
7.0
11
F
21
32
G
42
65
Pipet 100 µL of the zero calibrator A
into the NSB and A tubes, and 100 µL
of each remaining calibrator, control
and patient sample into the tubes
prepared. Pipet directly to the
bottom.
It is good practice to use a disposabletip micropipet, changing the tip
between samples, in order to avoid
carryover contamination.
3
Because nonspecific binding in the
Coat-A-Count procedure is
characteristically low, the NSB tubes
may safely be omitted without
compromising accuracy or quality
control.
Coated Tubes: Label fourteen Free T3
Ab-Coated Tubes A (maximum binding)
and B through G in duplicate. Label
additional antibody-coated tubes, also in
duplicate, for controls and patient
samples.
A (MB)
Do not attempt to dilute patient
samples expected to contain high
concentrations in the zero calibrator.
(Since dilution shifts the equilibrium
between free and bound T3, the assay
cannot be expected to maintain
linearity under dilution.)
Radioimmunoassay Procedure
Plain Tubes: Label four plain
(uncoated) 12×75 mm polypropylene
tubes T (total counts) and NSB
(nonspecific binding) in duplicate.
Approximate
pmol/L
Note: The values of the calibrators are
lot-specific. Refer to the calibrator vial
labels for values in pg/mL. To convert
to pmol/L, multiply by 1.536.
Storage: 2 days at 2–8°C, or for up to 2
months frozen at –20°C.
1
Approximate
pg/mL
Add 1.0 mL of
tube. Vortex.
125
I Free T3 to every
Laboratories equipped with a reliable
pipettor-diluter may handle steps 2
and 3 simultaneously, but care should
be taken to avoid carryover from tube
to tube. No more than 10 minutes
should elapse during the dispensing of
the tracer. Set the T tubes aside for
counting (at step 6); they require no
further processing.
4
Incubate for 3 hours at 37°C.
Use a waterbath; neither an oven nor
a heat block is suitable.
5
Decant thoroughly.
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. Using a
foam decanting rack, decant the
contents of all tubes (except the T
tubes) and allow them to drain for 2 or
3 minutes. Then strike the tubes
5
sharply on absorbant paper to shake
off all residual droplets.
6
Count for 1 minute in a gamma
counter.
Calculation of Results
To obtain results in terms of concentration
from a logit-log representation of the
calibration curve, first calculate for each
pair of tubes the average NSB-corrected
counts per minute:
Net Counts = (Average CPM) minus (Average
NSB CPM)
Note that other approaches, e.g. a sound
implementation of the 4-parameter logistic,
are also acceptable. See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Example Run: For illustration only, not for
calculating results from another run.
Because the calibrator values are
lot-specific, concentrations listed in the
right-most column may not match the
values of the calibrators supplied in your
shipment. (See "Example Run" table.)
Quality Control
Then determine the binding of each pair of
tubes as a percent of maximum binding
(MB), with the NSB-corrected counts of
the A tubes taken as 100%:
Controls (or serum pools) with at least two
free T3 concentration levels — low and
high — should routinely be assayed as
unknowns.
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
Report patient results only if the control
results meet your laboratory's established
criteria for acceptability.
(The calculation can be simplified by
omitting the correction for nonspecific
binding; samples within range of the
calibrators yield virtually the same results
when Percent Bound is calculated directly
from Average CPM.)
It is good laboratory practice to record for
each assay the lot numbers of the
components used, as well as the dates
when they were first reconstituted or
opened. We also recommend charting
control results from day to day — as
described, for example, in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Note that
repeat samples can serve as a valuable
additional tool for monitoring interassay
precision, and that pairs of control tubes
can be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
Using logit-log graph paper, plot Percent
Bound on the vertical (probability) axis
against Concentration on the horizontal
(logarithmic) axis for each of the nonzero
calibrators, and draw a straight line
approximating the path of these points.
Results for the unknowns may then be
read from the line by interpolation.
It is good practice to inspect results for
agreement within replicates, and to
construct a graph of the calibration curve
(even if the calculations are handled by
computer) as a visual check on the
appropriateness of the transformation
used and as a way to detect deviant
calibration points. We also recommend
keeping track of these data reduction
parameters:
T = Total Counts (as counts per minute)
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
Expected Values
Serum samples from 405 euthyroid adults
were assayed by Coat-A-Count Free T3
procedure (see the graph at the end of
this section.) Also assayed were samples
from 19 hyperthyroid and 13 hypothyroid
patients, as well as samples from women
in the first and third trimesters of
pregnancy. Analysis of the free T3 results
from these samples yielded the following
statistics.
%MB = 100 × (Net Counts / Total Counts)
And the 20, 50 and 80 percent
"intercepts," where
20% = Concentration at 20 Percent Bound, etc.
6
Central 95%
n
pg/mL
pmol/L
405
1.4 – 4.4
2.2 – 6.8
Hyperthyroid
19
5.2 – 22.6*
8.0 – 35*
Hypothyroid
13
0.3 – 3.1*
0.5 – 4.8*
1st Trimester
17
2.1 – 4.7*
3.2 – 7.2*
3rd Trimester
20
1.7 – 4.6*
2.6 – 7.1*
n
pg/mL
pmol/L
Euthyroid
405
2.8
4.3
Hyperthyroid
19
9.2
14
Hypothyroid
13
0.6
0.9
1st Trimester
17
3.0
4.6
3rd Trimester
20
3.1
4.8
Euthyroid
Pregnancy
*Absolute Range
Median
Pregnancy
Consider these limits as guidelines only.
Each laboratory should establish its own
reference ranges.
In severe nonthyroidal illness, the
assessment of thyroid status becomes
especially difficult. Since some patients in
this category may suffer from concomitant
primary hypothyroidism or from a
compensatory secondary hypothyroidism,
TSH immunoassay has been
recommended as a confirmatory test in
this context.
In rare conditions associated with extreme
variations in the albumin-binding capacity
— such as familial dysalbuminemic
hyperthyroxinemia (FDH) — direct free
thyroid hormone assays may yield
misleading results.
Circulating autoantibodies to T3, and
hormone-binding inhibitors, may interfere
2,3,11
with the assay.
Performance Data
See Tables and Graphs for data
representative of the Coat-A-Count Free
T3 kit's performance. Free T3 results in
the sections below are expressed as
pg/mL. Unless otherwise specified, all
results were generated on serum samples.
Conversion Factor:
pg/mL × 1.536 → pmol/L
Calibration Range: 0.5 to 42 pg/mL
(0.77 to 65 pmol/L) The calibrators are
lot-specific.
Analytical Sensitivity: 0.2 pg/mL
(0.31 pmol/L).
Limitations
The free T3 assay serves primarily as a
confirmatory test for hyperthyroidism and
is of very limited value in the context of
hypothyroidism. As indicated in the
Expected Values table, the great majority
of patients with hyperthyroidism will have
free T3 values exceeding the upper limit of
normal; but not all such patients will be
identifiable by this means, since there may
be some overlap between the euthyroid
and hyperthyroid ranges.
The interpretation of free T3 results is
complicated by a variety of drugs which
can affect the binding of T3 to the thyroid
hormone carrier proteins.
Intraassay Precision (Within-Run):
Precision for samples assayed in duplicate
is summarized graphically in the precision
profile, based on nine samples and
approximately twenty degrees of freedom.
(See "Precision Profile" graph.)
Interassay Precision (Run-to-Run):
Statistics were calculated for each of three
samples from the results of pairs of tubes
in 20 different assays. (See "Interassay"
table.)
End-of-Run Effect: none up to
approximately 200 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.)
Specificity: The antiserum is highly
specific for triiodothyronine. Relative
crossreactivities (on a weight-per-weight
basis at 50% binding) obtained with the
Coat-A-Count Free T3 kit are shown. (See
"Specificity" table.)
7
Bilirubin: Levels of 100 or 200 mg/L have
a marginal effect on the assay. (See
"Bilirubin" table.)
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 30 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
Alternate Sample Type: To assess the
effect of alternate sample types, blood
was collected from 32 volunteers into
plain, heparinized and EDTA and
vacutainer tubes. All samples were
assayed by the Coat-A-Count Free T3
procedure, with the following results.
Median (pg/mL)
Serum
Heparin
EDTA
3.4
2.9
2.7
Based on this study, it is recommended
that samples be collected as serum.
Effect of Albumin: For an analog-method
free T3 procedure to succeed, it is
essential that the analog tracer not bind to
endogenous transport proteins, including
TBG and albumin. Previous analog
methods for free T3 have been
significantly affected by variations in the
24
circulating level of albumin. The following
experiment was designed to demonstrate
that variations in the albumin level have
no effect on the Coat-A-Count Free T3
procedure. Five samples from females in
the third trimester of pregnancy were each
divided into four aliquots. Charcoalabsorbed human serum albumin (CAHSA)
was added in concentrations of 0, 10, 20
and 50 mg/mL, and the four aliquots were
then assayed in duplicate by the
Coat-A-Count Free T3 procedure. The
mean value for each albumin
concentration (n = 5) was then plotted
against the apparent free T3
concentration. It is evident from the figures
that results are unaffected by the addition
of albumin up to 5.0 g/dL, for a total
albumin concentration of approximately
8.0 g/dL. (See "Effect of Albumin" graph.)
Effect of Nonesterified Fatty Acids: To
determine whether free (nonesterified)
fatty acids interfere with the Coat-A-Count
Free T3 procedure, oleic acid — a
representative member of this family —
was spiked at various concentrations into
each of 4 patient samples. All samples
were than assayed by the Coat-A-Count
Free T3 procedure. Results for the four
8
samples were averaged. Increased levels
of free fatty acids are encountered in a
variety of conditions, including late
pregnancy and heparin therapy. The table
shows that the Coat-A-Count Free T3
procedure is essentially unaffected by
even major increases in the level of
circulating free fatty acids. (See "Effect of
Nonesterified Fatty Acids" table.)
Effect of Phenytoin: Patient samples
were spiked with up to 50 µg/mL
phenytoin. (Toxic: above 25 µg/mL.) The
samples were assayed, spiked and
unspiked, by the Coat-A-Count Free T3
procedure, with the results tabulated. The
results show that at levels of 10 µg/mL
and above, phenytoin does have a
clinically significant effect on the
Coat-A-Count Free T3 assay. (See "Effect
of Phenytoin" table.)
Effect of Phenylbutazone: Patient serum
samples were spiked with up to
1,000 µg/dL phenylbutazone. (Toxic:
above 20 µg/dL.) The samples were
assayed, spiked and unspiked, by the
Coat-A-Count Free T3 procedure, with the
results tabulated. The results show that
phenylbutazone has no in vitro effect on
the Coat-A-Count Free T3 procedure.
(See "Effect of Phenylbutazone" table.)
Effect of Salicylate: Patient samples
were spiked with up to 100 mg/dL
salicylate. (Toxic: above 30 mg/dL.) The
samples were assayed, spiked and
unspiked, by the Coat-A-Count Free T3
procedure. The results show that
salicylate has no in vitro effect on the
Coat-A-Count Free T3 procedure. (See
"Effect of Salicylate" table.)
Effect of TBG: In order to determine
whether thyroid hormone binding globulin
(TBG) will bind the analog tracer, the
following experiment was conducted using
125
the I analog tracer from the
Coat-A-Count Free T3 kit. TBG resin
stripped of all apparent T3 was added to
the zero calibrator at concentrations of 0,
1, 2 and 5 g/dL. These samples were
processed in the Coat-A-Count Free T3
procedure. If capable of binding to TBG,
less of the analog tracer would bind to the
immobilized antibody. The observed
percent bound (%B/B0) values shown in
the table indicate that the tracer does not
bind to TBG. (See "Effect of TBG" table.)
References
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thyroxine concentrations in familial thyroxinebinding globulin deficiency. J Clin Endocrinol
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physiology and pathology. In: Collu R,
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during normal pregnancy. Acta Endocrinol
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free thyronines. Clin Chem 1988;34:9-16 and
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Laboratory Standards. Procedures for the
collection of diagnostic blood specimens by
venipuncture; approved standard. 4th ed.
NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS,
1998.
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Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
9
Interassay Precision (pg/mL)
Tables and Graphs
Mean1
Example Run
Tube1
Duplicate Average
CPM2
CPM3
T7
56,150
56,109
56,058
(NSB)8
271
253
Net
CPM4
Approx.
Percent Free T3
5
Bound pg/mL6
C
CV3
1
2.4
0.21
8.8%
2
4.7
0.32
6.8%
3
10.0
0.50
5.0%
End of Run Effect
Tubes1
33–46
Tubes
99–112
Tubes
165–178
Tubes
231–244
1
2.1
2.1
2.3
2.0
2
2.9
2.5
3.0
2.8
3
3.8
3.8
3.5
3.4
4
4.5
4.0
4.2
4.0
5
5.7
5.5
6.0
5.5
6
9.4
9.0
9.6
8.6
7
10.5
9.7
10.1
10.0
262
A
27,338
27,360 27,098 100%
(MB)9 27,382
B
SD2
0
24,192
24,437 24,175 89.2%
24,682
0.5
21,761
21,751 21,489 79.3%
21,741
1.4
D
18,758
18,710 18,448 68.1%
18,662
3.0
E
14,837
15,021 14,759 54.5%
15,205
6.0
F
8,792
8,572
8,682
8,420 31.1%
21.0
G
5,397
5,491
5,444
5,182 19.1%
43.0
Unknowns:10
X1
21,266
21,167 20,905 77.1%
21,066
1.6
X2
16,191
16,076 15,814 58.4%
15,961
4.8
X3
12,516
12,880 12,618 46.6%
13,244
9.0
11
Quality Control Parameters:
T7 = 56,109 cpm
%NSB8 = 0.5%
%MB9 = 48.3%
20% Intercept12 = 41.7 pg/mL
50% Intercept = 7.5 pg/mL
80% Intercept = 1.3 pg/mL
Specificity
Compound1
% Crossreactivity2
Diiodo-L-tyrosine
1.4 × 10-4 %
5,5′-Diphenylhydantoin
0.98 × 10-6 %
3-Iodo-L-tyrosine
8.5 × 10-6 %
Methimazole
1.02 × 10-3 %
Phenylbutazone
3.15 × 10-5 %
6-n-Propyl-2-thyrouracil
4.4 × 10-5 %
Tetraiodothyroacetic acid
2.12 × 10-3 %
L-Thyroxine
(T4)
8.5 × 10-4 %
D-Thyroxine
3.2 × 10-3 %
Triiodothyroacetic acid
1.1 × 10-1 %
Effect of Albumin
Intraassay Precision (pg/mL)
10
Effect of Nonesterified Fatty Acids
Oleic Acid Added
(nmol/L)
1
Effect of Phenylbutazone
2
Observed Free T3*
(pg/mL)
Phenylbutazone1
µg/dL
Free T32
pg/mL
0
5.3
0
2.17
2.5
5.3
1
10
2.15
5.0
5.3
100
2.12
7.5
5.5
1,000
2.79
10.0
5.1
0
2.26
10
2.29
2
*Average of 43
Effect of Phenytoin
1
2
3
4
Phenytoin1
µg/mL
Free T32
pg/mL
0
2.1
5
2.7
10
3.0
25
4.8
50
6.8
0
2.2
5
2.3
10
2.8
25
4.1
50
5.6
0
2.9
5
2.5
10
3.3
25
4.8
50
8.3
0
4.6
5
4.8
10
5.5
25
7.2
50
11.0
100
2.17
1,000
3.43
0
2.26
10
2.03
3
100
2.12
1,000
2.86
0
4.7
10
4.2
4
100
4.7
1,000
5.8
0
10.8
10
10.1
5
100
11.0
1,000
12.9
Bilirubin (pg/mL)
Bilirubin1
2
Unspiked
100 mg/L
1
2.03
2.44
2.75
2
2.35
2.53
2.29
3
2.48
2.66
2.80
4
4.9
6.0
6.0
5
11.4
13.2
13.0
200 mg/L
11
Effect of Salicylate
Salicylate
mg/dL
1
1
Free T3
pg/mL
0
2.11
10
2.48
25
2.17
50
2.21
100
2.22
0
2.22
10
2.38
25
1.98
50
2.22
2
100
2.16
0
2.71
10
2.22
25
2.15
50
2.15
100
2.16
3
4
0
4.5
10
5.1
25
5.1
50
4.9
100
5.0
0
11.1
10
11.3
25
10.6
50
11.0
100
11.3
5
2
Effect of TBG
TBG Added1 (g/dL)
Binding2 (%B/B0)
0
100%
1
99%
2
99%
5
95%
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6Ca. Freies T3, pg/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Unbekannte,
11
Qualitätskontrollparameter, 1220% Intercept.
Interassay Precision: 1Mittelwert, 2SD
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). End-of-Run Effect:
1
Röhrchen. Specificity: 1Verbindung, 2%
12
Kreuzreaktivität. Effect of Nonesterified Fatty
Acids: 1Ölsäure zugegeben, 2Beobachtetes
Freies T3. Effect of Phenytoin: 1Phenytoin,
2
Freies T3. Effect of Phenylbutazone:
1
Phenylbutazon, 2Freies T3. Effect of Bilirubin:
1
Bilirubin, 2Ohne Zugabe von. Effect of
Salicylate: 1Salizylat, 2Freies T3. Effect of
TBG: 1TBG zugegeben, 2Freies T3.
Español. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Media CPM, 4 CPM Netas, 5Porcentaje
de unión, 6T3 Libre, aprox., pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Desconocido, 11Parámetros
del control de calidad, 12Corte al 20%.
Interassay Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Endof-Run Effect: 1Tubos. Specificity:
1
Compuesto, 2% Reacción cruzada. Effect of
Nonesterified Fatty Acids: 1Ácido oleico
añadidos, 2Observado T3 Libre. Effect of
Phenytoin: 1Fenitoína, 2T3 Libre. Effect of
Phenylbutazone: 1Fenilbutazona, 2T3 Libre.
Effect of Bilirubin: 1Bilirubina, 2Sin añadir.
Effect of Salicylate: 1Salicilato, 2T3 Libre.
Effect of TBG: 1TBG añadidos, 2T3 Libre.
Français. Example Run: 1Tube, 2Duplicate
CPM, 3 CPM moyen, CPM corrigé,
5
Pourcentage lié, 6Approx. T3 Libre, pg/mL,
7
Total, 8%NSB, 9%MB, 10Inconnus, 11Paramètres
Contrôle de Qualité, 1220% Intercept. Interassay
Precision: 1Moyenne, 2SD, 3CV. End-of-Run
Effect: 1Tubes. Specificity: 1Composé,
2
Réaction croisée%. Effect of Nonesterified
Fatty Acids: 1Acide oléique ajouté, 2Observé T3
Libre. Effect of Phenytoin: 1Phénytoïne, 2T3
Libre. Effect of Phenylbutazone:
1
Phénylbutazone, 2T3 Libre. Effect of Bilirubin:
1
Bilirubine, 2Non chargés. Effect of Salicylate:
1
Salicylate, 2T3 Libre. Effect of TBG: 1TBG
ajouté, 2T3 Libre.
Italiano. Example Run: 1Provetta, 2CPM in
duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti,
5
Percentuale di Legato, 6Appross. T3 Libera,
pg/mL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10Campioni Non
Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità,
12
Intercetta al 20%. Interassay Precision:
1
Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV
(Coefficiente di Variazione). End-of-Run Effect:
1
Provette. Specificity: 1Composto, 2Percentuale
di Crossreattività. Effect of Nonesterified Fatty
Acids: 1 Aggiunto Acido Oleico, 2 T3 Libera
Osservata. Effect of Phenytoin: 1Fenitoina, 2 T3
Libera. Effect of Phenylbutazone:
1
Fenilbutazone, 2 T3 Libera. Effect of Bilirubin:
1
Bilirubina, 2Semplice. Effect of Salicylate:
1
Salicilato, 2 T3 Libera. Effect of TBG: 1
Aggiunta TBG, 2 T3 Libera.
Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem
de Ligação, 6Aprox. T3 Livre, pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Amostras Desconhecidas,
11
Parâmetros do controlo de qualidade, 1220%
Intercepção. Interassay Precision: 1Média,
2
Desvio padrão, 3Coeficiente de variação. Endof-Run Effect: 1Tubos. Specificity: 1Composto,
2
Percentagem de reacção cruzada. Effect of
Nonesterified Fatty Acids: 1Ácido Oleico
Adicionado, 2 T3 Livre Observada. Effect of
Phenytoin: 1Fenitoína, 2 T3 Livre. Effect of
Phenylbutazone: 1Fenilbutazona, 2 T3 Livre.
Effect of Bilirubin: 1Bilirubina, 2Não adicionada.
Effect of Salicylate: 1Salicilato, 2 T3 Livre.
Effect of TBG: 1TBG Adicionada, 2 T3 Livre.
Deutsch
Coat-A-Count Freies T3
Anwendung: Festphasen
Radioimmunoassay (beschichtete
Röhrchen) zur direkten quantitativen
Bestimmung des freien T3 im Serum.
Der Test ist ausschließlich in der In-VitroDiagnostik im Zusammenhang mit der
klinischen Bewertung des
Schilddrüsenstatus einzusetzen.
Konzentration. Die T3-Konzentration ist
aber nicht nur vom Schilddrüsenstatus
und von der peripheren Umsetzung T4 zu
T3 abhängig sondern zusätzlich von der
Konzentration der Transportproteine. Die
Freie T3-Konzentration ist von diesen
Schwankungen der
Transportproteinkonzentration
unabhängig. Besonders die TBGKonzentration ist unter verschiedenen
Bedingungen wie Schwangerschaft,
Einnahme oraler Kontrazeptiva und
Östrogen-Therapie erhöht, was zu einer
Erhöhung des Gesamt-T3 Spiegels führt,
während die Konzentration des freien T3
unverändert bleibt.
Normalerweise beschreibt die freie T3Konzentration den aktuellen
Schilddrüsenstatus des Patienten besser
als die Gesamt-T3 Konzentration.
Artikelnummer: TKF31 (100 Tests)
Methodik
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 4,5 Microcurie
(167 Kilobequerel) an
125
radioaktivem I-markiertem T3-Analog.
Das Coat-A-Count Freies T3 Verfahren ist
ein Festphasen Radioimmunoassay, bei
125
dem I-markiertes Freies T3 Analog eine
vorgegebene Zeit mit dem Freien T3 im
Patientenserum um die Bindung an
spezifische Antikörper, die auf die
Innenwand von Polypropylen-Röhrchen
fest aufgebracht sind, konkurriert. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wird der
Überstand abgegossen oder abgesaugt
und die an die Antikörper gebundene
Fraktion in einem Gamma-Counter
gemessen. Die Counts sind zu der
Konzentration umgekehrt proportional.
Klinische Relevanz
Unter physiologischen Bedingungen
beträgt der Anteil von Trijodothyroxin (T3)
circa 5% an den Schilddrüsenhormonen
im Plasma. Obwohl das T3 in deutlich
geringerer Konzentration vorliegt als das
T4, zeigt es eine größere metabolische
Aktivität, einen schnelleren Umsatz und
eine breitere Verteilung im Organismus.
Der größte Anteil T3 wird durch die
Konversion aus T4 gebildet. Wie das T4,
ist der Hauptteil des T3 im Plasma an die
Transportproteine TBG, Präalbumin und
Albumin gebunden. Die ungebundene
Fraktion, das Freie T3, hat nur einen
Anteil von circa 0,25% an der gesamten
T3-Konzentration im Plasma.
Bei verschiedenen, gut beschriebenen
klinischen Fragestellungen, ist die
Bestimmung des T3 von Bedeutung.
Werden erhöhte Freie- oder Gesamt-T4
Werte gefunden, unterstützt die Messung
des T3 die Diagnosestellung des
Hyperthyreoidismus. Deutlich erhöhte T3Werte, bei normalen T4-Konzentrationen,
werden bei der „T3-Toxikose“ (T3Hyperthyreose) gefunden.
Normalerweise korreliert die Freie T3Konzentration mit der totalen T3Coat-A-Count Free T3 (PITKF3-8, 2010-10-22)
Die Konzentration des freien T3 wird mit
diesem Testsatz direkt in nur einem
9
Teströhrchen bestimmt. Es handelt sich
nicht um eine Berechnung als Funktion
von Gesamt T3. Die Methode
unterscheidet sich demnach von der
Gleichgewichtsdialyse oder dem Freien T3
Index. Die Bestimmung des freien T3
erfolgt in nur einem Schritt ohne
Vorinkubation oder vorherige Abtrennung
des freien T3 durch Dialyse, Filtration oder
Säulenchromatographie.
Der Coat-A-Count Freies T3 Assay wurde
125
so optimiert, dass alle Bindungen des I
Freies T3 Analog an exogene Proteine
verhindert werden, während das
Gleichgewicht zwischen Freiem T3 und
Protein-gebundenem T3 in der
Patientenprobe unbeeinflusst bleibt. Das
125
I Freies T3 Analog selber besitzt keine
13
nachweisbare Affinität zum TBG, dem
hauptsächlichen Schilddrüsenhormon125
Bindungsprotein. Um Bindungen des I
Freies T3 Analog an Albumin
auszuschließen, sind
Blockierungsreagenzien anwesend, die in
einer sorgfältig gewählten Konzentration
die Freisetzung des nativen T3 aus
endogenen Transportproteinen zu
vermeiden. Um das Risiko des „Ablösens“
zu minimieren verwendet das System
einen Antikörper mit einer niedrigen
Konzentration, der eine etwas geringere
Affinität für T3 hat, als das TBG. Die
Reaktion findet unter physiologischen
Bedingungen von Temperatur, pH und
Ionenstärke statt.
Nicht Albumin-verursachte Artefakte:
Siemens Healthcare Diagnostics FT3
Analog-Methode zeichnet sich durch die
Nutzung einer effektiven, entsprechend
optimierten Konzentration von Albumin
blockierenden Reagenzien aus. Dies
verhindert Artefakte, wie sie so häufig bei
anderen kommerziell erhältlichen AnalogTracer-Methoden in Verbindung mit
Schwangerschaften im dritten Trimester,
NTI (nonthyroidal illness) und
Heparintherapie gefunden werden –
Umstände, die anomale Spiegel von
Albumin und/oder freien Fettsäuren zur
Folge haben. (eine weitergehende
Betrachtung dieses Themas findet sich in
24
Witherspoon, El Shami, et al.
Hintergrundinformationen lassen sich in
der Broschüre „Albumin-Related Artifacts
in Free Thyroid Hormone Assays“ finden,
erhältlich bei Siemens Healthcare
Diagnostics.)
Referenzwerte: Der empfohlene
Referenzbereich von 1,4–4,4 pg/ml
(2,2–6,8 pmol/l) ist im wesentlichen
übereinstimmend mit modernen
Referenzmethoden, nämlich direkten
Radioimmunoassays für Freies T3 in
Serum Dialysaten. Die Fähigkeit des
Coat-A-Count Freies T3 Testbestecks
zwischen hyperthyreoten Proben und
euthyreoten Kontrollen zu unterscheiden,
wurde ausgiebig an klinisch bestätigten
Proben getestet. Die Genauigkeit wurde
des Weiteren in Proben von Schwangeren
und NTI-Patienten bestätigt.
Zu pipettierende Reagenzien: 1
Inkubationszeit: 3 Stunden bei 37°C
14
Totalaktivität zum Zeitpunkt der
Markierung: ca. 60 000 cpm
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnostik.
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) als
Konservierungsmittel hinzugefügt. Um die
Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen.
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall ist
unter Beachtung der gültigen Richtlinien
zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
Die in diesem Kit enthalten Bestandteile
sind nicht austauschbar mit denen im
Coat-A-Count Gesamt T3 Kit.
Freies T3 Antikörper-beschichtete
Röhrchen (TF31)
Polypropylen-Röhrchen beschichtet mit
Antikörpern gegen das Triiodothyronin
(T3), verpackt in wiederverschließbaren
Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor
Feuchtigkeit schützen und nach dem
Öffnen wieder sorgfältig verschließen.
Lagerung bei 2–8°C bis zum
Verfallsdatum. Farbe: Aquamarin.
TKF31: 100 Röhrchen.
125
I Freies T3 (TF32)
Lyophilisierter Tracer, mit jodiertem T3
Analog. Jede Flasche mit 110 ml
destilliertem oder deionisertem Wasser
rekonstituieren. 10 Minuten stehen lassen
u. durch vorsichtiges Umdrehen mischen.
Bei 2–8°C für 30 Tage nach der
Rekonstitution oder bis zum Verfallsdatum
auf der Flasche haltbar.
TKF31: 1 Flasche.
Freies T3 Standards (F3C3–9)
7 Flaschen mit lyophilisiertem,
behandeltem Humanserum, A – G.
Mindestens 30 Minuten vor Testbeginn,
den 0-Standard mit 2,0 ml destilliertem
oder deionisiertem Wasser und die
restlichen Standards B – G mit je 1,0 ml
destilliertem oder deionisiertem Wasser
auflösen. Volumetrische Pipetten
verwenden und durch vorsichtiges
Umdrehen mischen. Bei 2–8°C für 30
Tage nach der Rekonstitution haltbar.
TKF31: 1 Set.
Die rekonstituierten Standards haben
Chargenspezifische Freies T3 Werte von
ca. 0/ 0,5/ 1,6/ 3,5/ 7,0/ 21 und 42 pg/ml
bzw. ca. 0/ 0,77/ 2,5/ 5,4/ 11/ 32 und
65 pmol/l. Die exakten Konzentrationen
entnehmen Sie bitte den Etiketten der
Standardflaschen. Um Konzentrationen in
pmol/l zu erhalten müssen die Werte mit
1,536 multipliziert werden.
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gammacounter – kompatibel mit
12x75 mm Röhrchen
Wirbelmischer
Reagenzienvorbereitung
Messzylinder: 110 ml
Volumetrische Pipetten: 1,0 und 2,0 ml
Destilliertes oder deionisiertes Wasser
Radioimmunoassay
Unbeschichtete 12x75 mm PolyprophylenRöhrchen – für T und NSB Röhrchen,
erhältlich bei Siemens Healthcare
Diagnostics (Artikelnummer: PPO).
Mikropipetten: 100 µl und 1 000 µl
Wasserbad — für Inkubation bei 37°C.
Heizblock oder Ofen dürfen nicht
verwendet werden.
Gradilla de espuma — disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Artikelnummer: FDR).
Logit-Log-Papier
Immunoassay-Kontrolle (>25 Parameter, 3
Konzentrationen) (Artikelnummer: CON6).
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
25
Venenpunktion in Röhrchen ohne
Zusätze (ohne Antikoagulantien),
Trennung des Serums von den Blutzellen
durch Zentrifugation.
Es wurde gezeigt, dass Heparin in vitro
wie auch in vivo einen Einfluss auf freie
8
Schilddrüsenhormone hat. Aus diesem
Grund sollten während oder kurz nach
Heparin-Gabe keine Proben entnommen
werden.
Lipämische, ikterische oder stark
kontaminierte Proben können zu
fehlerhaften Ergebnissen führen. Der
Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur
Klärung von lipämischen Proben
empfohlen.
Hämolysierte Proben können auf eine
unsachgemäße Behandlung der Proben
vor dem Eingang im Labor deuten, daher
sollten die Ergebnisse mit Vorsicht
interpretiert werden.
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
15
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count Freies
T3 sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
Details der getesteten Röhrchenarten sind
dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu
entnehmen.
Erforderliche Menge: 100 µl Serum pro
Röhrchen.
2
Durchführung
Radioimmunoassay
Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
1
Da die unspezifische Bindung im
Coat-A-Count RIA normalerweise
niedrig ist, hat sie keinen signifikanten
Einfluss auf die Messwerte. Es kann
deshalb auch auf das Mitführen der
NSB-Röhrchen verzichtet werden.
ca. pmol/l
0
B
0,5
0,77
C
1,6
2,5
D
3,5
5,4
E
7,0
11
F
21
32
G
42
65
Jeweils 100 µl des 0-Standards A in
die NSB und A Röhrchen und jeweils
100 µl der restlichen Standards,
Kontrollen und Patientenproben in die
vorbereiteten Röhrchen pipettieren.
Direkt auf den Boden des
Röhrchens pipettieren.
Es ist gute Laborpraxis Pipetten mit
Einmalspitzen zu verwenden und die
Spitze von Probe zu Probe zu
wechseln um Verschleppung zu
vermeiden.
3
125
Jeweils 1,0 ml I Freies T3 Analog
hinzufügen. Mischen.
Mit Hilfe eines Pipettor-Dilutors
können die Schritte 2 und 3 auch
simultan durchgeführt werden, aber
eine Verschleppung von Röhrchen zu
Röhrchen sollte vermieden werden.
125
Das Verteilen des I Freies T3
Analog sollte nicht länger als 10
Minuten dauern. Die T-Röhrchen bis
zur Messung (siehe Schritt 6) beiseite
stellen; sie bedürfen keiner weiteren
Behandlung.
4
16
0
Proben mit zu erwartenden hohen
Konzentrationen dürfen nicht mit 0Standard verdünnt werden. (Eine
Verdünnungslinearität kann nicht
erwartet werden, da sich durch die
Verdünnung das Gleichgewicht
verschiebt.)
Unbeschichtete Röhrchen: Jeweils
2 unbeschichtete 12x75 mm
Polypropylen-Röhrchen mit T (TotalAktivität) und NSB (unspezifische
Bindung) beschriften.
Beschichtete Röhrchen: Jeweils 2
Antikörper-beschichtete Freies T3
Röhrchen mit A (maximale Bindung, 0Standard) und von B bis G beschriften.
Jeweils 2 weitere Antikörper-beschichtete
Röhrchen für Kontrollen und
Patientenproben beschriften.
ca. pg/ml
A (MB)
Es ist zu beachten, dass die Werte
der Standards chargen-spezifisch
sind. Die exakten Konzentrationen
entnehmen Sie bitte den Etiketten der
Standardflaschen. Um
Konzentrationen in pmol/l zu erhalten
müssen die Werte mit 1,536
multipliziert werden.
Lagerung: 2 Tage bei 2–8°C, oder für bis
zu 2 Monaten gekühlt bei –20°C.
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen und
vorsichtig durchmischen. Bei Bedarf
portionieren, um wiederholtes Einfrieren
und Auftauen zu vermeiden. Gefrorene
Proben dürfen nicht durch Erhitzen im
Wasserbad aufgetaut werden.
Standards
Für 3 Stunden bei 37°C im
Wasserbad inkubieren.
Ofen oder Heizblock dürfen nicht
verwendet werden.
5
Vollständig dekantieren.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Mit Hilfe eines
Dekantierständers alle Röhrchen
(außer die T-Röhrchen) dekantieren
oder absaugen und 2–3 Minuten
umgedreht stehen lassen.
Anschließend werden die Röhrchen
kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um
alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.
6
Alle Röhrchen für 1 Minute im
Gamma Counter messen.
Berechnung der Ergebnisse
Um die Konzentrationen aus der Logit-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen,
werden zunächst die Mittelwerte der
Röhrchenpaare, bereinigt um den
Mittelwert der NSB Counts pro Minute
(cpm) berechnet:
Netto Counts = (Mittelwert CPM) minus
(Mittelwert NSB CPM)
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB) bestimmt. Hierzu
werden die mittleren CPM des AStandards korrigiert um die mittlere NSB
als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
(Die Berechnung kann durch Weglassen
der Korrektur um die NSB vereinfacht
werden. Für Proben innerhalb des
Standardbereichs werden nahezu
identische Konzentrationen berechnet,
wenn B/B0 direkt aus den CPM ermittelt
wird.)
Die so ermittelten B/B0 aller Standards
außer des 0-Standards werden auf der yAchse auf Logit-Log Papier gegen die
Konzentration auf der x-Achse
(logarithmisch) aufgetragen. Die Punkte
werden mit bestmöglicher Annäherung
durch eine gerade Linie verbunden. Die
Ergebnisse der unbekannten Proben
können dann durch Interpolation an der
Kurve abgelesen werden.
Es ist gute Laborpraxis die Ergebnisse der
Doppelbestimmung auf Übereinstimmung
zu prüfen und eine Grafik der
Standardkurve zu erstellen (auch wenn
die eigentliche Berechnung durch ein
Computerprogramm erfolgt), um visuell zu
überprüfen, ob für die Standardkurve die
geeignete Transformation verwendet
wurde und um eventuell abweichende
Standardkurvenpunkte zu entdecken. Es
wird weiterhin empfohlen, folgende
Parameter der Berechnung zu
protokollieren:
T = Totalaktivität (als Counts pro Minute)
%NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)
und die 20, 50 und 80 Prozent
"Schnittpunkte" wobei
20% = Konzentration bei 20 Prozent Bindung,
etc.
Bitte beachten Sie, dass auch andere
Auswertungen z. B. nach der 4-Parameter-Logistik akzeptabel sind. (Siehe:
“Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985;31:1264-71)
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet Werte aus einem anderen
Testansatz zu ermitteln. Aufgrund der
Chargenabhängigkeit der Standardkonzentrationen müssen die in der
rechten Spalte der Tabelle gelisteten
Konzentrationen nicht mit den Konzentrationen in Ihrer Lieferung übereinstimmen. (Siehe “Example Run” Tabelle.)
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen Kontrollen mit
mindestens 2 Freies T3 Konzentrationen
(niedrig und hoch) routinemäßig als
unbekannte Proben einzusetzen.
Patientenergebnisse dürfen nur dann
freigegeben werden, wenn die
laborspezifischen Akzeptanzkriterien
erfüllt sind. Hierzu sind die jeweils gültigen
Richtlinien zu berücksichtigen.
Es ist gute Laborpraxis die
Chargennummern, sowie das Datum der
ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der
verwendeten Komponenten zu
protokollieren. Die wiederholte Messung
von Proben kann bei der Beurteilung der
Interassay Präzision hilfreich sein. Der
Einsatz von Kontrollprobenpaaren an
unterschiedlichen Positionen des
17
Testansatzes ist hilfreich, um eine
eventuelle Drift zu erkennen.
Grenzen der Methode
Referenzwerte
Es wurden Serumproben von 405
euthyreoten Erwachsenen im Coat-ACount Freies T3 RIA getestet (Siehe
Grafik, am Ende dieses Abschnittes).
Zusätzlich wurden Proben von 19
hyperthyreoten und 13 hypothyreoten
Patienten sowie von Schwangeren im
ersten und dritten Trimester getestet.
Analysen der Freies T3 Ergebnisse dieser
Proben führten zu folgender Statistik.
zentraler 95% Bereich
n
pg/ml
pmol/l
Euthyreose
405 1,4 – 4,4
Hyperthyreose
19 5,2 – 22,6* 8,0 – 35*
2,2 – 6,8
Hypothyreose
13 0,3 – 3,1*
0,5 – 4,8*
1. Trimester
17 2,1 – 4,7*
3,2 – 7,2*
3. Trimester
20 1,7 – 4,6*
2,6 – 7,1*
Schwangerschaft
*Absolut Bereich
Median
n
pg/ml
pmol/l
Euthyreose
405
2,8
4,3
Hyperthyreose
19
9,2
14
Hypothyreose
13
0,6
0,9
1. Trimester
17
3,0
4,6
3. Trimester
20
3,1
4,8
Schwangerschaft
Die genannten Bereiche sind als Richtlinie
zu interpretieren. Jedes Labor sollte seine
eigenen Referenzbereiche etablieren.
Der Assay zur Bestimmung der freien T3Konzentration ist ein Bestätigungstest der
Hyperthyreose und hat nur eine
eingeschränkte Aussagekraft im
Zusammenhang mit der Hypothyreose.
Wie die Referenzwerttabelle zeigt, hat die
große Mehrheit der Patienten mit einer
Hyperthyreose freie T3 Werte über dem
normalen Bereich, aber nicht alle dieser
Patienten sind über diese Mittelwerte
identifizierbar. Es ist davon auszugehen,
dass es Überschneidungen zwischen
euthyreoten und hyperthyreoten
Bereichen gibt.
Die Interpretation der Freien T3
Ergebnisse wird durch eine Vielzahl von
Medikamenten erschwert, die die T3Bindung an die entsprechenden
Bindeproteine beeinflussen.
Besonders schwierig ist die Untersuchung
der Schilddrüsenfunktion bei nicht
thyreoidalen Erkrankungen (NTI). Einige
Patienten mit diesem Krankheitsbild leiden
unter einer begleitenden primären
Hypothyreose oder einer
kompensatorischen sekundären
Hypothyreose. In diesem Zusammenhang
wird der TSH Immunoassay zur
Bestätigung empfohlen.
In seltenen Fällen starker Variation der
Albuminbindungskapazität, wie familiärer
dysalbuminämischer Hyperthyroxinämie,
werden fehlerhafte Bestimmungen der
freien Hormone beobachtet.
Zirkulierende T3-Autoantikörper und
Inhibitoren für Hormonbindung können mit
2,3,11
dem Assay interferieren.
Leistungsdaten
Siehe Tabellen und Grafiken mit
repräsentativen Daten für das Coat-ACount Freies T3 Testbesteck. Die
Ergebnisse sind in pg/ml angegeben. Alle
Daten wurden, sofern nicht anders
angegeben, aus Serumproben gewonnen.
Umrechnungsfaktor:
pg/ml × 1,536 → pmol/l
Messbereich: 0,5 – 42 pg/ml
(0,77 – 65 pmol/l) Die Standards sind
chargenspezifisch.
Analytische Sensitivität: 0,2 pg/ml
(0,31 pmol/l),
18
Intraassay Präzision (Within-Run): Die
Präzision für Proben in
Doppelbestimmung ist grafisch in einem
Präzisionsprofil zusammengefasst
worden, basierend auf 9 Proben und ca.
20 Freiheitsgraden. (Siehe Grafik
"Precision Profile".)
Interassay Präzision (Run-to-Run):
Statistische Berechnung der Ergebnisse
von 3 Proben, die in 20 Röhrchenpaaren
in verschiedenen Ansätzen gemessen
wurden. (Siehe Tabelle “Interassay”.)
„End-of-Run“ Effekt: Tritt bis zu ca.
200 Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle
"End-of-Run Effect".)
Spezifität: Das verwendete Antiserum ist
hoch spezifisch für Trijodthyronin. Es
werden die relativen Kreuzreaktivitäten
(auf Basis der Einwaage bei 50%Bindung) gemessen mit dem
Coat-A-Count Freies T3 Testbesteck,
dargestellt. (Siehe Tabelle "Specificity".)
Bilirubin: Konzentrationen von 100 oder
200 mg/l haben einen marginalen Einfluss
auf den Assay. (Siehe Tabelle "Bilirubin".)
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml
keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der
größer als die Unpräzision des Assays
selbst ist.
Alternativer Probentyp: Um die
Auswirkungen von verschiedenen
Probenarten zu untersuchen, wurde Blut
von 32 Freiwilligen in Röhrchen ohne
Additiva, in Heparin- und EDTA- Becton
Vacutainer-Rörchen gesammelt. Alle
Proben wurden mit dem Coat-A-Count
Freies T3 Assay mit den nachfolgend
aufgeführten Ergebnissen bestimmt.
Median pg/ml
Serum
Heparin
EDTA
3,4
2,9
2,7
Auf der Basis dieser Untersuchungen wird
empfohlen Serumproben zu verwenden.
Einfluss von Albumin: Für die akkurate
Messung einer Freies T3-Analog-Methode
125
ist es wesentlich, dass das I Freies T3
Analog nicht an endogene
Transportproteine inkl. TBG und Albumin
bindet. Frühere Freies T3-AnalogMethoden wurden durch veränderte
Spiegel des zirkulierenden Albumins
24
signifikant beeinflusst. Das folgende
Experiment wurde entworfen, um zu
zeigen, dass Veränderungen des Albumin
Spiegels keinen Einfluss auf das
Coat-A-Count Freies T3 Verfahren haben.
5 Proben von Schwangeren im dritten
Trimester wurden in 4 Portionen aufgeteilt
und Aktivkohle-absorbiertes humanes
Serum-Albumin (CAHSA) wurde in
Konzentrationen von 0, 10, 20 und
50 mg/ml zugegeben. Anschließend
wurden die 4 Portionen in
Doppelbestimmung mit dem Coat-A-Count
Freies T3 Verfahren gemessen. Der
Mittelwert jeder Albumin-Konzentration
(n = 5) wurde dann gegen die vorhandene
Freie T3 Konzentration aufgetragen. Aus
der Darstellung geht offensichtlich hervor,
dass die Ergebnisse durch die Zugabe
von Albumin bis zu 5,0 g/dl und einer
Gesamtkonzentration von ca. 8,0 g/dl
unbeeinflusst bleiben. (Siehe Grafik
"Effect of Albumin".)
Einfluss von nicht veresterten
Fettsäuren (NEFA): Um festzustellen, ob
freie (nicht veresterte) Fettsäuren mit dem
Coat-A-Count Freies T3 Verfahren
interferieren, wurde Ölsäure – ein
repräsentativer Vertreter dieser Gruppe –
in verschiedenen Konzentrationen jeder
der 4 Patientenproben zugesetzt. Dann
wurden alle Proben im Coat-A-Count
Freies T3 Verfahren gemessen. Die
Ergebnisse für die 4 Proben wurden
gemittelt. Ansteigende Spiegel freier
Fettsäuren treten unter verschiedensten
Bedingungen auf, z.B. später
Schwangerschaft und unter
Heparintherapie. Wie die Tabelle zeigt,
bleibt das Coat-A-Count Freies T3
Verfahren auch bei sehr starken
Anstiegen der zirkulierenden freien
Fettsäuren im Wesentlichen unbeeinflusst.
(Siehe Tabelle "Effect of Nonesterified
Fatty Acids".)
Einfluss von Phenytoin:
Patientenproben wurden mit bis zu
50 µg/ml Phenytoin versetzt. (Toxisch:
über 25 µg/ml.) Alle Proben, versetzte und
unversetzte, wurden mit dem Coat-ACount Freies T3 Verfahren gemessen, die
Ergebnisse sind in der Tabelle aufgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass bei Spiegeln
von 10 µg/ml und höher, Phenytoin einen
klinisch signifikanten Einfluss auf das
Coat-A-Count Freies T3 Verfahren hat.
(Siehe Tabelle "Effect of Phenytoin".)
Einfluss von Phenylbutazon:
Patientenproben wurden mit bis zu
19
1 000 µg/dl Phenylbutazon versetzt.
(Toxisch: über 20 µg/dl.) Alle Proben,
versetzte und unversetzte, wurden mit
dem Coat-A-Count Freies T3 Verfahren
gemessen, die Ergebnisse sind in der
Tabelle aufgeführt. Die Ergebnisse
zeigen, dass Phenylbutazon in vitro
keinen Einfluss auf das Coat-A-Count
Freies T3 Verfahren hat. (Siehe Tabelle
"Effect of Phenylbutazone".)
Einfluss von Salizylat: Patientenproben
wurden mit bis zu 100 mg/dl Salizylat
versetzt. (Toxisch: über 30 mg/dl.) Alle
Proben, versetzte und unversetzte,
wurden mit dem Coat-A-Count Freies T3
Verfahren gemessen, die Ergebnisse sind
in der Tabelle aufgeführt. Die Ergebnisse
zeigen, dass Salizylat keinen in vitro
Einfluss auf das Coat-A-Count Freies T3
Verfahren hat. (Siehe Tabelle "Effect of
Salicylate".)
Einfluss von TBG: Um zu bestimmen, in
wie weit das Schilddrüsenhormonbindende Globulin (TBG) das Freies T3Analogon bindet, wurde das folgende
125
Experiment mit dem I Freies T3 Analog
aus dem Coat-A-Count Freies T3
Testbesteck durchgeführt. TBG, durch
Kunstharz von vorhandenem T3 befreit,
wurde dem 0-Standard in Konzentrationen
von 0, 1, 2 und 5 g/dl zugesetzt. Diese
Proben wurden im Coat-A-Count Freies
T3 Verfahren gemessen. Würde die
Fähigkeit an TBG zu binden bestehen,
125
würde nur wenig des I Freies T3 Analog
an den immobilisierten Antikörper binden.
Die in der Tabelle dargestellten
beobachteten %-Bindungen (%B/B0)
125
zeigen, dass das I Freies T3 Analog
nicht an TBG bindet. (Siehe Tabelle
"Effect of TBG".)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
20
Español
Coat-A-Count T3 Libre
Utilidad del análisis: El kit Coat-A-Count
125
T3 libre es un ( I) radioinmunoanálisis en
fase sólida, diseñado para la
determinación cuantitativa de los niveles
de T3 libre en suero. Su uso es
estrictamente para el diagnóstico in vitro,
como una ayuda en la evaluación clínica
del estado tiroideo.
Referencia: TKF31 (100 tubos)
El kit de 100 tubos contiene
menos de 4,5 microcurios (167
kilobequerelios) de un análogo de
125
T3 marcado con I radioactivo.
Resumen y explicación del Test
Bajo condiciones fisiológicas normales, la
triiodotironina (T3) representa
aproximadamente el 5 por ciento de la
hormona tiroidea en el plasma. Si bien
está presente en una concentración más
baja que la tiroxina (T4), la T3 tiene una
actividad metabólica más alta, un
recambio más rápido y un volumen de
distribución mayor. Se produce en gran
parte a través de la conversión
extratiroidea de T4. Al igual que la T4,
circula casi completamente unida a
proteínas trasportadoras TBG,
prealbúmina y albúmina. En la circulación,
la T3 libre sólo constituye el 0,25% de la
T3 total.
La medición de T3 total por
inmunoensayo tiene un número de usos
bien establecidos. A menudo se la emplea
para ayudar a confirmar un diagnóstico de
hipertiroidismo, en donde se han
encontrado concentraciones elevadas de
T4 libre o total. También pueden ocurrir
elevaciones anormales de T3 total en el
contexto de T4 total normal, una condición
conocida como “T3 toxicosis.”
En la mayoría de los casos, las
concentraciones de T3 libre guardan una
correlación estrecha con las
concentraciones de T3 total. Sin embargo,
la T3 total no sólo está en función del
estado tiroideo y la conversión periférica
de T4 a T3, sino también de la
concentración de las proteínas que se
unen a la hormona tiroidea. Por otra parte,
la T3 libre no está afectada por las
variaciones en estas proteínas
trasportadoras. Por lo tanto, las
elevaciones de TBG típicas en el
embarazo, los anticonceptivos orales y la
terapia con estrógenos inducirán un
aumento en la concentración de T3 total
dejando la concentración de T3 libre
básicamente inalterada.
Típicamente, las concentraciones de T3
libre reflejarán el estado tiroideo real de
los pacientes en forma más confiable que
las concentraciones de T3 total.
Principio del análisis
El procedimiento Coat-A-Count T3 libre es
un radioinmunoanálisis en fase sólida, en
el cual un análogo de T3 marcado
125
radiactivamente con I compite, durante
un periodo de tiempo determinado, con la
T3 libre de la muestra del paciente por los
sitios de unión en el anticuerpo específico
para T3. Debido a que el anticuerpo está
inmovilizado en la pared de un tubo de
polipropileno, la decantación del
sobrenadante es suficiente para terminar
la competencia y aislar la fracción de T3
libre marcada radiactivamente que se ha
unido al anticuerpo. El tubo luego se lee
en un contador gama en donde produce
un número que está inversamente
relacionado con la concentración de T3
libre presente en la muestra del paciente.
El procedimiento Coat-A-Count T3 libre es
9
un análisis directo o de un tubo, en el
sentido de que sus resultados no se
calculan como una función de T3 total,
sino que se interpolan de una curva de
calibración calibrada en términos de
concentraciones de T3 libre. En este
respecto, el análisis difiere de los métodos
clásicos de diálisis de equilibrio y también
de las llamadas determinaciones del
índice de T3 libre. También es un análisis
de una etapa, que no requiere de un paso
de preincubación ni del aislamiento
preliminar de la fracción mediante diálisis
o cromatografía en columna.
El sistema Coat-A-Count T3 libre ha sido
optimizado para eliminar toda la unión del
trazador análogo de T3 a las proteínas
endógenas, dejando esencialmente sin
alterar el equilibrio original entre la T3 libre
y la T3 unida a proteínas en la muestra
del paciente. El trazador por sí mismo no
tiene una afinidad medible para la
globulina fijadora de tiroxina sérica (TBG),
la principal proteína transportadora de la
hormona tiroidea. Para prevenir que el
trazador se una a la albúmina, hay
agentes bloqueantes presentes en una
concentración cuidadosamente ajustada
para evitar el desplazamiento de la T3
nativa unida a las proteínas
transportadoras endógenas. Para
minimizar aún más el riesgo de remoción,
el sistema emplea un anticuerpo, a una
concentración baja, cuya afinidad por la
T3 es ligeramente menor que la de TBG, y
funciona bajo condiciones fisiológicas de
temperatura, pH y fuerza iónica.
Artefactos no relacionados con la
albúmina: El método análogo del sistema
de T3 libre de Siemens Healthcare
Diagnostics se distingue por el uso de una
concentración eficaz y apropiadamente
optimizada de agentes que bloquean la
albúmina. Esto elimina los artefactos
vistos muy frecuentemente con otros
métodos análogos comercialmente
disponibles en conexión con el embarazo
en el tercer trimestre, la enfermedad no
tiroidea y la terapia con heparina, en
condiciones que implican niveles
anormales de albúmina y de ácidos
grasos libres. (Para una discusión
completa de esta cuestión, ver los
24
artículos de Witherspoon, El Shami et al.
Se puede encontrar información
pertinente en la monografía AlbuminRelated Artifacts in Free Thyroid Hormone
Assays, disponible en Siemens
Healthcare Diagnostics).
Valores esperados: El intervalo de
referencia recomendado de 1,4 –
4,4 pg/ml (2,2 – 6,8 pmol/l) concuerda
sustancialmente con los métodos de
referencia modernos, a saber,
radioinmunoensayos directos para T3 libre
en dialisados séricos. La capacidad del kit
Coat-A-Count T3 Libre de discriminar
entre muestras hipertiroideas y controles
eutiroideos ha sido muy probada en
muestras clínicamente confirmadas. Su
precisión ha sido adicionalmente
verificada en muestras de mujeres
embarazadas y de pacientes con
enfermedad no tiroidea.
Reactivos a pipetear: 1
Tiempo total de incubación: 3 horas a
37°C
21
Cuentas totales en la iodización:
aproximadamente 60 000 cpm
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Reactivos: Almacenar de 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radiactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesiten
ciertas precauciones.
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al VIH 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sódica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminación,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitución de residuos de
azidas metálicas, potencialmente
explosivas, en las cañerías de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada.
Radiactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
general) emitido a la aduana de los
EE.UU. se registrará en los ficheros de
Siemens Healthcare Diagnostics antes de
que se puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radiactivo. Estos
materiales radiactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radiactivos
pueden adquirirse solo por médicos,
veterinarios en la práctica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales — y estrictamente para la
clínica in vitro o tests de laboratorio que
no conlleven la administración interna o
externa de material radiactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
22
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EE.UU. o de un Estado con el NRC para
su consiguiente control.
Manejar los materiales radiactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos
radiactivos de acuerdo con los
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radiactivos
como residuos no radiactivos, después de
retirar las etiquetas. Licencias específicas
(NRC Form 313) se deben referir al Título
10, Código de Regulaciones Federales,
Parte 20. Las licencias en Estados
Asociados deben referirse a las
normativas de su correspondiente Estado.
Licencias generales pueden eliminar sus
residuos líquidos radiactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido, quitando las
etiquetas de los contenedores y
procesándolos como residuos sólidos.
Licencias específicas pueden eliminar
pequeñas cantidades de residuos líquidos
radiactivos contenidos en este tipo de
productos como cualquier otro material
líquido. Refiérase a la normativa aplicable
a su laboratorio.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Note que los materiales suministrados en
este kit no son intercambiables con
aquellos del kit Coat-A-Count T3 Total.
Tubos recubiertos de anticuerpo frente
a la T3 libre (TF31)
Tubos de polipropileno recubiertos con
anticuerpos anti-triiodotironina (T3) y
embalados en bolsas de cierre hermético.
Almacenar refrigerados y protegidos de la
condensación, cerrando cuidadosamente
las bolsas después de su uso. Estable a
2–8°C hasta la fecha de caducidad
impresa en la bolsa. Color: Aguamarina.
TKF31: 100 tubos.
125
I T3 libre (TF32)
Trazador liofilizado que consiste de un
análogo de T3 iodizado. Reconstituir cada
vial añadiendo 110 ml de agua destilada o
desionizada. Dejar descansar durante 10
minutos, luego mezclar por inversión
suave. Estable a 2–8°C durante 30 días
después de la reconstitución, o hasta la
fecha de caducidad impresa en el vial.
TKF31: 1 vial.
Calibradores de T3 libre (F3C3–9)
Siete viales de suero humano procesado
liofilizado, marcados A a G. Por lo menos
30 minutos antes de usar, reconstituir el
calibrador cero A con 2,0 ml de agua
destilada o desionizada, y cada tubo de
los calibradores restantes B a G con
1,0 ml de agua destilada o desionizada.
Usar pipetas volumétricas y mezclar con
movimientos circulares suaves. Estable a
2–8°C durante 30 días después de la
reconstitución.
TKF31: 1 juego.
Los calibradores reconstituidos tienen
valores de T3 libre lote-específicos de
aproximadamente 0, 0,5, 1,6, 3,5, 7,0, 21
y 42 picogramos de T3 libre por mililitro
(pg/ml); equivalentemente tienen valores
de aproximadamente 0, 0,77, 2,5, 5,4, 11,
32 y 65 picomoles por litro (pmol/l).
Consultar las etiquetas para los valores
exactos en pg/ml. Para convertir a pmol/l,
multiplicar por 1,536.
Materiales Requeridos pero no
suministrados
Contador Gamma compatible con tubos
de 12 x 75 mm.
Vortex
Preparación de los reactivos
Probeta graduada: 110 ml
Pipetas volumétricas: 1,0 ml y 2,0 ml
Agua destilada o desionizada
Radioinmunoanálisis
Tubos de ensayo de polipropileno de
12 x 75 mm para su uso como tubos NSB,
disponibles en Siemens Healthcare
Diagnostics (Referencia: PPO).
Micropipetas: 100 µl y 1 000 µl
Baño de agua capaz de mantener la
temperatura a 37°C. No es apropiado el
uso de una estufa ni de un bloque
calefactor.
Gradilla de decantación – disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Referencia: FDR).
Papel gráfico Logit-log
Un control de inmunoanálisis, a tres
niveles, basado en suero humano, que
contiene T3 libre como uno de sus 25
constituyentes, disponible en Siemens
Healthcare Diagnostics (Referencia:
CON6).
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
25
venipunción en tubos no tratados, y
separar el suero de las células
sanguíneas.
Se ha informado que la heparina tiene
efectos in vivo e in vitro sobre las
8
hormonas tiroideas libres. Por lo tanto, no
se deberá recoger muestras durante o
poco después de administrar este
anticoagulante.
Las muestras lipémicas, ictericas o
ampliamente contaminadas pueden dar
resultados erróneos. Se recomienda el
uso de una ultracentrífuga para aclarar las
muestras lipémicas.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de las muestras
antes de ser recibidas por el laboratorio;
en este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. El T3 libre Coat-A-Count
no ha sido analizado con todos los
distintos tipos de tubos. Para obtener
detalles sobre los tipos tubos que se han
analizado, consulte la sección de Tipos de
Muestras Alternativos.
23
Volumen requerido: 100 µl suero por
tubo.
Conservación: 2 días a 2–8°C o hasta
2 meses (congeladas) a –20°C.
convertir a pmol/l, multiplicar por
1,536.
2
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente (15–
28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si
es necesario, para evitar la repetición de
congelación y descongelación. No intentar
la descongelación de muestras
congeladas calentándolas en un baño de
agua.
No intentar diluir las muestras que se
prevén con alta concentración en el
calibrador cero. (Como la dilución
rompe el equilibrio entre la T3 libre y
la unida, el sistema de ensayo puede
no mantener la linealidad después de
la dilución).
Procedimiento del
Radioinmunoanálisis
Es una buena práctica el uso de
micropipetas con punta desechables,
cambiando las puntas entre las
muestras, para evitar la
contaminación por arrastre.
Todos los componentes deben llevarse a
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
su uso.
Tubos de ensayo: Marcar cuatro
tubos de ensayo de polipropileno (sin
recubrir) 12 x 75 mm. Tubos T
(cuentas totales) y NSB (unión no
específica), por duplicado.
1
3
Calibradores
Aproximado
pg/ml
Aproximado
pmol/l
A (MB)
0
0
B
0,5
0,77
C
1,6
2,5
D
3,5
5,4
E
7,0
11
F
21
32
G
42
65
Nota: Los valores de los calibradores
son lote específicos. Ver las etiquetas
de cada vial de calibrador para
conocer el valor en pg/ml. Para
24
125
Añadir 1,0 ml de I T3 libre a todos
los tubos. Mezclar en el Vortex.
Los laboratorios que tengan un equipo
confiable para dilución automática
pueden hacer los pasos 2 y 3
simultáneamente, pero se deberá
tener cuidado de evitar la
contaminación por arrastre de un tubo
a otro. No se debe tardar más de 10
minutos durante la dispensación del
trazador. Dejar los tubos T a un lado
para su contaje (paso 6); no requieren
más procesamiento posterior.
Al ser la unión no específica en el
ensayo Coat-A-Count
característicamente baja, los tubos
NSB pueden ser omitidos sin
comprometer la precisión y control de
calidad del ensayo.
Tubos recubiertos: Marcar catorce tubos
recubiertos de anticuerpo frente a la T3
libre: A (máxima unión) y B a G por
duplicado. Marcar tubos adicionales
recubiertos con anticuerpo, también por
duplicado, para los controles y las
muestras de pacientes.
Pipetear 100 µl del calibrador cero A
en los tubos NSB y A, y 100 µl del
resto de los calibradores, controles y
muestras de los pacientes en sus
correspondientes tubos. Pipetear
directamente en el fondo del tubo.
4
Incubar durante 3 horas a 37°C.
Usar un baño de agua; no es
apropiado el uso de un horno ni de un
bloque calefactor.
5
Decantar.
Eliminar toda la humedad visible para
mejorar la precisión. Decantar el
contenido de todos los tubos (excepto
los tubos T) y dejar escurrir durante 2
o 3 minutos. Golpear los tubos contra
papel absorbente para eliminar las
gotas residuales.
6
Contar durante 1 minuto en un
contador gamma.
Cálculo de resultados
Para obtener resultados en términos de
concentración a partir de una
representación logit-log de la curva de
calibración, primero hay que calcular para
cada pareja de tubos las cuentas medias
por minuto corregidas con el NSB:
Cuentas netas = (Media CPM) menos
(Media NSB CPM)
Entonces, determinar la unión de cada
pareja de tubos como un porcentaje de la
unión máxima (MB), tomando las cuentas
corregidas con el NSB de los tubos A
como 100%:
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
(El cálculo puede simplificarse omitiendo
la corrección de las uniones no
específicas; las muestras dentro del rango
de calibración van a dar virtualmente el
mismo resultado cuando el porcentaje de
unión se calcula directamente a partir de
la media de las CPM).
Usando papel gráfico logit-log, representar
el porcentaje de unión en el eje vertical
frente a la concentración en el eje
horizontal (logarítmico) para cada
calibrador no cero y trazar la línea que
pase por esos puntos aproximadamente.
Los resultados de las muestras pueden
ser leídos en la curva por interpolación.
Es una buena práctica inspeccionar los
resultados para comprobar la
concordancia entre los replicados, y
realizar una gráfica de la curva de
calibración (aunque los cálculos se
realicen por ordenador) para ver la
transformación más apropiada a usar y las
posibles desviaciones en los puntos de
calibración. También, recomendamos
mantener un registro de los siguientes
parámetros de la reducción de datos:
T = Cuentas totales (como cuentas por minuto)
%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / cuentas
totales)
%MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales)
Y los cortes 20, 50 y 80 por ciento, donde
20% = Concentración al 20 por ciento de unión,
etc.
específicos, las concentraciones
expresadas en la columna derecha no
pueden coincidir con los valores de los
calibradores suministrados en su envío.
(Ver tabla "Example Run").
Control de Calidad
Se deben procesar de manera rutinaria al
menos dos niveles de controles (o pool de
sueros) con diferente concentración de T3
libre — baja y alta.
Informar los resultados de los pacientes
sólo si los resultados de los controles para
este ensayo están dentro de los criterios
de aceptabilidad establecidos por su
laboratorio.
Es una buena práctica de laboratorio
registrar para cada ensayo los números
de lote de los componentes usados, así
como las fechas en las que fueron
abiertos por primera vez y reconstituidos.
También recomendamos el uso de
gráficos diarios de los controles — como
se describe, por ejemplo, en Westgard
JO, et al. A multi-rule chart for quality
control. Clin Chem 1981;27:493-501. Las
muestras repetidas pueden servir como
una herramienta de valor adicional para
monitorizar la precisión interensayo, y que
las parejas de los tubos del control
pueden espaciarse a lo largo de la tanda
de ensayo para verificar la ausencia de
deriva significativa.
Valores esperados
Se analizaron muestras de suero de 405
adultos eutiroideos mediante el
procedimiento Coat-A-Count T3 Libre (ver
el gráfico al final de esta sección).
También se analizaron muestras de 19
pacientes hipertiroideos y de 13 pacientes
hipotiroideos, así como muestras de
mujeres en el primer y tercer trimestre del
embarazo. El análisis de los resultados de
T3 libre para estas muestras produjo las
estadísticas
Otras aproximaciones, por ejemplo,
logística 4-parámetros, también son
aceptables. Ver Dudley RA, et al.
“Guidelines for immunoassay data
reduction”. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados. Al
ser los valores de los calibradores loteCoat-A-Count Free T3 (PITKF3-8, 2010-10-22)
25
95% central
n
pg/ml
pmol/l
405
1,4 – 4,4
2,2 – 6,8
Hipertiroideo
19
5,2 – 22,6*
8,0 – 35*
Hipotiroideo
13
0,3 – 3,1*
0,5 – 4,8*
1° trimestre
17
2,1 – 4,7*
3,2 – 7,2*
3° trimestre
20
1,7 – 4,6*
2,6 – 7,1*
Eutiroideo
Embarazo
*Rango absoluto
Mediana
n
pg/ml
pmol/l
Eutiroideo
405
2,8
4,3
Hipertiroideo
19
9,2
14
Hipotiroideo
13
0,6
0,9
1° trimestre
17
3,0
4,6
3° trimestre
20
3,1
4,8
Embarazo
Estos límites han de considerarse sólo
como una guía. Cada laboratorio deberá
establecer sus propios intervalos de
referencia.
La interpretación de los resultados de T3
libre se ve complicada por una variedad
de fármacos que pueden afectar la unión
de la T3 con proteínas transportadoras de
la hormona tiroidea
En la enfermedad no tiroidea grave, la
evaluación del estado tiroideo resulta
especialmente difícil. Debido a que
algunos pacientes de esta categoría
pueden sufrir hipotiroidismo primario
concomitante o hipotiroidismo secundario
compensatorio, se ha recomendado
utilizar el radioinmunoanálisis de TSH
como una prueba confirmatoria en este
contexto.
En raras condiciones asociadas con
variaciones extremas en la capacidad de
unión de la albúmina, como en la
hipertiroxinemia familiar disalbuminémica
(FDH), los análisis directos de la hormona
tiroidea libre pueden producir resultados
engañosos.
Los autoanticuerpos circulantes para T3 y
los inhibidores de la unión de la hormona
2,3,11
pueden interferir con el ensayo.
Características analíticas
Para obtener datos representativos del
rendimiento del kit Coat-A-Count T3 Libre,
ver la sección Tablas y Gráficos. Los
resultados de T3 libre en las secciones
siguientes se expresan en pg/ml. A menos
que se especifique lo contrario, todos los
resultados fueron generados en muestras
de suero.
Factor de Conversión:
Limitaciones
El análisis de T3 libre sirve primariamente
como un test de confirmación para el
hipertiroidismo, y tiene un valor muy
limitado en el contexto del hipotiroidismo.
Como se indicó en la tabla de Valores
Esperados, la gran mayoría de los
pacientes con hipertiroidismo tendrá
valores de T3 libre por arriba del límite
superior del valor normal, pero no todos
esos pacientes serán identificables por
este medio, ya que puede haber
superposición entre los rangos eutiroideos
y los hipertiroideos.
26
Intervalo de calibración: 0,5 – 42 pg/ml
(0,77 – 65 pmol/l) Los calibradores son
lote-específicos.
Sensibilidad analítica: 0,2 pg/ml
(0,31 pmol/l),
Precisión intraensayo (dentro de una
tanda): La precisión para las muestras
analizadas por duplicado se resume
gráficamente en el perfil de precisión,
basado en nueve muestras y
aproximadamente veinte grados de
libertad. (Ver la tabla "Interassay
Precision").
Precisión entre ensayos (de una tanda
a otra): Las estadísticas se calcularon
para las muestras a partir de los
resultados obtenidos por duplicado en 20
ensayos diferentes. (Ver la tabla
"Interassay Precision").
Efecto deriva: Efecto deriva: Ninguno
hasta aproximadamente 200 tubos. (Ver la
tabla "End-of-Run Effect").
Especificidad: El antisuero es altamente
específico para triiodotironina. Se
muestran las reacciones cruzadas
relativas (en una base peso en peso a
aproximadamente 50% de unión),
obtenidas con el kit Coat-A-Count T3
Libre. (Véase la tabla "Specificity").
Bilirrubina: Las concentraciones de 100
o 200 mg/l tienen un efecto marginal
sobre el análisis. (Ver la tabla "Bilirubin").
Hemólisis: La presencia de eritrocitos
hasta concentraciones de 30 µl/ml no
tiene efecto en los resultados, en lo
concerniente a la precisión del ensayo.
Tipo de Muestra Alternativa: para
evaluar el efecto de los diferentes tipos de
muestras alternativos, se recogió sangre
de 32 voluntarios en tubos normales,
tubos con Heparina y tubos con EDTA
vacutainer. Todas las muestras fueron
analizadas con el procedimiento Coat-ACount T3 Libre, con los siguientes
resultados.
Mediana pg/ml
Suero
Heparina
EDTA
3,4
2,9
2,7
En base a estos resultados, se
recomienda que las muestras se recojan
como suero.
Efecto de la albúmina: Para que un
procedimiento de T3 libre con el método
análogo sea exitoso, es esencial que el
trazador análogo no se una a las
proteínas transportadoras endógenas,
incluyendo TBG y albúmina. Métodos
anteriores con análogos de T3 libre fueron
significativamente afectados por
variaciones en el nivel circulante de
24
albúmina. El siguiente experimento fue
diseñado para demostrar que las
variaciones en el nivel de albúmina no
tienen ningún efecto sobre el
procedimiento Coat-A-Count T3 Libre.
Cada una de cinco muestras de mujeres
que se encontraban en el tercer trimestre
del embarazo fueron divididas en cuatro
alícuotas. Se añadió albúmina sérica
humana absorbida en carbón (CAHSA) en
concentraciones de 0, 10, 20 y 50 mg/ml,
y se analizaron las cuatro alícuotas por
duplicado mediante el procedimiento
Coat-A-Count T3 Libre. Luego se graficó
el valor medio para cada concentración de
albúmina (n = 5) en función de la
concentración aparente de T3 libre. A
partir de la figura, es evidente que los
resultados no se ven afectados por la
adición de hasta 5,0 g/dl de albúmina,
para una concentración de albúmina total
de aproximadamente 8,0 g/dl. (Ver el
gráfico "Effect of Albumin").
Efecto de los ácidos grasos no
esterificados: Para determinar si los
ácidos grados libres (no esterificados)
interfieren con el procedimiento Coat-ACount T3 Libre, se añadieron varias
concentraciones de ácido oleico, un
miembro representativo de esta familia, a
cada una de 4 muestras de pacientes.
Estas muestras luego se procesaron
mediante el procedimiento Coat-A-Count
T3 Libre. Los resultados de las cuatro
muestras se promediaron. En una
variedad de condiciones, incluyendo los
últimos meses del embarazo y la terapia
con heparina, se encuentran niveles
elevados de ácidos grasos libres. La tabla
muestra que el nivel de ácidos grasos
libres circulantes, incluso niveles muy
elevados, no afecta el procedimiento
Coat-A-Count T3 Libre. (Ver la tabla
"Effect of Nonesterified Fatty Acids").
Efecto de la fenitoina: Se cargaron
muestras de pacientes con
concentraciones de hasta 50 µg/ml de
fenitoina. (Tóxico: por arriba de 25 µg/ml).
Estas muestras se analizaron, cargadas y
no cargadas, mediante el procedimiento
Coat-A-Count T3 Libre. Los resultados
indican que a concentraciones de
10 µg/ml y superiores, la fenitoina no tiene
un efecto clínicamente significativo sobre
el procedimiento Coat-A-Count T3 Libre.
(Ver la tabla "Effect of Phenytoin").
Efecto de la fenilbutazona: Se cargaron
muestras séricas de pacientes con
concentraciones de hasta 1 000 µg/dl de
fenilbutazona. (Tóxico: por arriba de
20 µg/dl). Estas muestras se analizaron,
cargadas y no cargadas, mediante el
procedimiento Coat-A-Count T3 Libre. Los
resultados muestran que la fenilbutazona
no tiene ningún efecto in vitro sobre el
procedimiento Coat-A-Count T3 Libre.
(Ver la tabla "Effect of Phenylbutazone").
27
Efecto del salicilato: Se cargaron
muestras de pacientes con
concentraciones de hasta 100 mg/dl de
salicilato. (Tóxico: por arriba de 30 mg/dl).
Estas muestras se analizaron, cargadas y
no cargadas, mediante el procedimiento
Coat-A-Count T3 Libre. Los resultados
muestran que el salicilato no tiene ningún
efecto in vitro sobre el procedimiento
Coat-A-Count T3 Libre. (Ver la tabla
"Effect of Salicylate".)
Efecto de TBG: Para determinar si la
globulina fijadora de tiroxina sérica (TBG)
se unirá al trazador análogo, se realizó un
125
experimento usando un I trazador
análogo del kit Coat-A-Count T3 Libre.
Después de remover toda la T3 aparente
de la resina conjugada con TBG, esta se
añadió al calibrador cero a
concentraciones de 0, 1, 2 y 5 g/dl. Estas
muestras se procesaron mediante el
procedimiento Coat-A-Count T3 Libre. Si
el trazador análogo fuera capaz de unirse
a TBG, la cantidad del trazador que se
uniría al anticuerpo inmovilizado sería
menor. Los valores observados de
porcentaje de unión (%B/B0) que se
muestran en la tabla indican que el
trazador análogo no se une a TBG. (Ver la
tabla "Effect of TBG").
Asistencia técnica
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Français
Coat-A-Count T3 Libre
Domaine d'utilisation : la technique
Coat-A-Count T3 Libre est un dosage
radioimmunologique en phase solide pour
la mesure quantitative directe de la T3
libre dans le sérum. Réservé à un usage
diagnostique in vitro. Ce dosage constitue
une aide à l'évaluation clinique du bilan
thyroïdien.
28
Référence catalogue : TKF31 (100 tubes)
Le coffret de 100-tubes contient
moins de 4,5 micro-curies
(167 kilobecquerels) d'analogue
de la T3 marquée à l'iode 125.
Introduction
Dans les conditions physiologiques
normales, la T3 représente
approximativement 5% des hormones
thyroïdiennes dans le plasma. Bien que
présente en très faible quantité
comparativement à la T4, la T3 a une plus
grande activité métabolique, un
renouvellement plus rapide et un plus
grand volume de distribution. La T3 est
produite en grande quantité par la
conversion de la T4 en dehors de la
glande thyroïde. Comme pour la T4, elle
circule presque entièrement liée à des
protéines de transport, la TBG, la préalbumine et l'albumine. La T3 libre
constitue seulement 0,25% de la T3 totale
circulante.
La détermination de la T3 libre par
immunoanalyse a des indications bien
établies. En présence d'une élévation de
T4 totale ou de T4 libre, le dosage de la
T3 aide à confirmer le diagnostic
d'hyperthyroïdie. Une augmentation
anormale de T3 peut également se voir
alors que la T4 est normale en cas de
« hyperthyroïdie à T3 ».
Dans la plupart des cas, les taux de T3
libre sont parfaitement corrélés aux taux
de T3 totale. Cependant les taux de T3
totale ne dépendent pas seulement de
l'état thyroïdien et de la conversion
périphérique de la T4 en T3, mais aussi
de la concentration des protéines
porteuses. D'autre part, la T3 libre est peu
affectée par les variations de ces
protéines porteuses. Ainsi, l'élévation
typique de la TBG au cours de la
grossesse, de la prise de contraceptifs
oraux ou d'œstrogénothérapie, entraîne
une augmentation de la T3 totale, mais ne
modifie pas la concentration basale de T3
libre.
Dans la plupart des cas, la concentration
de T3 libre reflète de façon beaucoup plus
fiable le statut thyroïdien actuel du patient
que la T3 totale.
Principe du test
Le dosage Coat-A-Count T3 Libre est un
dosage radioimmunologique en phase
solide. Au cours de l'incubation, il y a
compétition entre un analogue de la T3
marquée à l'iode 125 et la T3 libre de
l'échantillon, vis-à-vis des sites de
l'anticorps. L'anticorps étant fixé sur la
paroi des tubes en polypropylène, après
incubation, il suffit d'éliminer le surnageant
par décantation pour isoler facilement la
fraction radioactive liée à l'anticorps. Le
tube est ensuite compté sur un compteur
gamma, les cpm étant inversement
proportionnels à la concentration de T3
libre présente dans l'échantillon qui sera
déterminée à l'aide d'une courbe standard.
La technique Coat-A-Count T3 Libre est
9
un dosage direct ou « à tube unique », en
ce sens que le résultat n'est pas calculé
sur la T3 totale mais directement lu sur
une courbe standardisée en termes de T3
libre. ElIe se différencie ainsi des
méthodes de dialyse à l'équilibre ou de
mesure d'indice de T3. C'est un dosage
en une seule étape, ne demandant ni
préincubation, ni séparation préliminaire
de la fraction libre par dialyse ou
chromatographie sur colonne.
Le dosage Coat-A-Count T3 Libre utilise
plusieurs fonctions permettant de
préserver l'équilibre entre la T3 libre et liée
pour doser spécifiquement la fraction libre.
Premièrement, pour empêcher la fixation à
l'albumine de l'analogue de T3 marqué,
des agents bloquants ont été ajoutés à
une concentration optimale, afin d'éviter
tout déplacement du taux de T3 à partir
des protéines de transport endogènes.
Les agents bloquants minimisent aussi les
artefacts qui peuvent se produire lors de
taux anormaux d'albumine ou d'acides
gras. Deuxièmement : l'analogue luimême n'a pas d'affinité mesurable pour la
TBG. Troisièmement : Pour minimiser le
risque de libération de T3 à partir des
protéines de transport, ce test utilise un
anticorps à une faible concentration,
l'anticorps utilisé a une affinité avec la T3
identique à celle de l'albumine, évitant la
dissociation de l'hormone et des protéines
de transport des hormones thyroïdiennes.
Enfin, le dosage s'effectue à température,
pH et force ionique physiologique.
Absence d'artéfacts liés à l'albumine :
le système analogique à la T3 de Siemens
Healthcare Diagnostics se distingue par
l'utilisation d'une concentration optimisée
efficace d'agents bloqueurs de l'albumine.
Ceci permet d'éliminer les artéfacts
communément observés lors de
l'utilisation d'autres méthodes analogiques
disponibles dans le commerce en cas de
grossesse au troisième trimestre, de
maladies non thyroïdiennes et de
traitement à l'héparine, qui entraînent des
taux d'albumine et/ou d'acides gras libres
anormalement élevés. (Voir les articles de
24
Witherspoon, El Shami, et al. pour une
discussion complète. Voir la monographie
Albumin-Related Artifacts in Free Thyroid
Hormone Assays, disponible auprès de
Siemens Healthcare Diagnostics, pour des
renseignements de fond.)
Valeurs attendues : l'intervalle de
référence recommandé de 1,4–4,4 pg/ml
(2,2–6,8 pmol/l) est essentiellement en
accord avec les méthodes de référence
modernes en ce qui concerne les dosages
radio-immunométriques directs de la T3
libre en dialysats de sérum. La capacité
du coffret Coat-A-Count T3 Libre à
distinguer les échantillons
hyperthyroïdiens des contrôles
euthyroïdiens a été testée en profondeur à
l'aide d'échantillons confirmés
cliniquement. Sa précision a également
été vérifiée à l'aide d'échantillons prélevés
sur des femmes enceintes et des patients
atteints de maladies non thyroïdiennes.
Réactifs à distribuer : 1
Temps d'incubation totale : 3 heures à
37°C.
Activité totale en début de marquage :
environ 60 000 cpm
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2/+8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
29
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-HCV et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Eau : utiliser de l'eau distillée ou
désionisée.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est réservé à l'usage
in vitro (Autorisation DGSNR).
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à
+ 4/+ 8° C dans leur conditionnement
d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
30
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés. Les
réactifs radioactifs ne peuvent être vendus
qu'à des personnes habilitées à manipuler
des substances radioactives.
Matériel fourni :
préparation initiale
Noter que les réactifs fournis avec ce
coffret ne sont pas interchangeables avec
ceux du coffret Coat-A-Count Total T3.
Tubes revêtus d'anticorps anti-T3
(TF31)
Tubes en polypropylène revêtus
d'anticorps anti-T3 dans des sachets à
glissière. Les conserver réfrigérés et
protégés de l'humidité, bien refermer les
sachets après utilisation. Stable à +2/+8°C
jusqu'à la date d'expiration notée sur le
sachet. Couleur : bleu vert.
TKF31 : 100 tubes.
T3 marquée à l'iode 125 (TF32)
Traceur lyophilisé d'un analogue de la T3,
reconstituer chaque flacon avec 110 ml
d'eau distillée, laisser 10 minutes puis
mélanger par retournement avant emploi.
Stable à +2/+8°C pendant 30 jours après
reconstitution ou jusqu'à la date
d'expiration notée sur le flacon.
TKF31 : 1 flacon.
Calibreurs T3 Libre (F3C3–9)
Sept flacons A à G, de calibreurs de T3
libre, lyophilisé dans du sérum humain
prétraité, au moins 30 minutes avant
emploi, reconstituer le calibreur zéro A
avec 2,0 ml d'eau distillée, les calibreurs
B à G avec 1,0 ml chacun. Utiliser des
pipettes volumétriques et agiter
doucement. Stable à +2/ +8 °C pendant
30 jours après reconstitution.
TKF31 : 1 jeu.
Les calibreurs ont des valeurs spécifiques
à chaque lot et contiennent environ 0, 0,5,
1,6, 3,5, 7,0, 21 et 42 picogrammes de T3
libre par millilitre (pg/ml) en matrice sérum
humain traité équivalents à : 0, 0,77, 2,5,
5,4, 11, 32 et 65 picomoles par litre
(pmol/l). Se référer aux étiquettes pour les
valeurs exactes en ng/ml de T3 libre des
calibreurs. Multiplier par 1,536 pour des
pmol/l.
Matériel requis mais non fourni
Compteur gamma permettant l'utilisation
de tubes standard 12x75 mm
Agitateur de type Vortex
Préparation des réactifs
Cylindre gradué : 110 ml
Pipettes volumétriques : 1,0 ml et 2,0 ml
Eau distillée ou désionisée
Dosage radioimmunologique
Tubes secs en polypropylène 12x75 mm à
utiliser pour les tubes LNS, disponibles
auprès de Siemens Healthcare
Diagnostics (Référence catalogue : PPO).
Micropipettes : 100 µl et 1 000 µl
Bain-marie pouvant maintenir une
température d'incubation de 37°C. Ni
étuve ni plaque chauffante ne sont
adaptées à ce dosage.
Un portoir de décantation disponible
auprès de Siemens Healthcare
Diagnostics (Référence catalogue : FDR).
Papier graphe Logit-log
Un contrôle de dosage immunologique à
base de sérum humain, à trois niveaux de
concentration, contenant de la T3 libre
(parmi plus de 25 constituants dosables),
est disponible auprès de Siemens
Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : CON6).
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
25
Prélever le sang par ponction veineuse
et le recueillir sur tubes secs (sans anticoagulant). Séparer le sérum des cellules,
par centrifugation.
Il a été démontré que l'héparine a des
effets in vivo et in vitro sur les
concentrations sériques d'hormones
8
thyroïdiennes libres, aussi est-il
déconseillé de prélever des échantillons
pour ce dosage pendant et après
administration de cet anticoagulant.
Des échantillons lipémiques, ictériques ou
fortement contaminés peuvent donner des
résultats érronés. Il est recommandé de
clarifier les échantillons hyperlipémiques
par ultracentrifugation.
La présence d'hémolyse dans les
échantillons peut indiquer qu'un spécimen
a été manipulé de façon incorrecte avant
réception par le laboratoire. Il est bon
d'interpréter avec précaution les résultats
obtenus sur de tels échantillons.
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
coffret T3 Libre Coat-A-Count n'a pas été
testé sur tous les types de tubes
possibles. Veuillez consulter le chapitre
intitulé Autres Types d'Échantillons pour
plus de renseignements sur les tubes qui
ont été évalués.
Volume nécessaire : 100 µl de sérum par
tube.
Conservation : 2 jours à +2/+8° C ou 2
mois à –20°C.
Avant le dosage, laisser les échantillons
revenir à température ambiante (15–
28°C), mélanger doucement par rotations
ou retournement. Aliquoter, si nécessaire,
afin d'éviter de répéter les cycles
congélation / décongélation. Ne pas tenter
de décongeler les spécimens congelés au
bain marie.
Protocole de dosage
Tous les composants doivent être à
température ambiante avant leur utilisation
(15–28°C).
1
Tubes secs : Etiqueter deux séries
de tubes (non revêtus) en
polypropylène 12x75 mm tubes T et
LNS (Liaison Non Spécifique) en
duplicate.
La valeur du LNS dans la technique
Coat-A-Count étant très faible, elle
peut être négligée sans que la
précision ou le contrôle de qualité ne
soient modifiés.
31
Tubes revêtus d'anticorps : Etiqueter 14
tubes revêtus d'anticorps anti-T3, A
(liaison maximale B0) et de B à G en
duplicate. Etiqueter les tubes revêtus
d'anticorps anti-T3 supplémentaires,
également en duplicate, pour les contrôles
et les échantillons patients.
Calibreurs
pg/ml environ
A (MB)
0
0
B
0,5
0,77
C
1,6
2,5
D
3,5
5,4
E
7,0
11
F
21
32
G
42
65
Pipeter 100 µl du calibreur zéro A
dans les tubes de LNS et les tubes
A (B0). Pipeter 100 µl de chacun des
autres calibreurs, contrôles et
échantillons de patients dans les
tubes correspondants préparés.
Pipeter directement au fond du
tube.
Ne pas diluer les échantillons
supposés contenir de forte
concentration en T3 libre: la dilution
fausserait l'équilibre naturel de la T3
avec ses protéines de liaison, le
dosage n'est pas linéaire après
dilution.
Il est bon d'utiliser des embouts de
micropipettes jetables, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
3
Ajouter 1,0 ml de T3 libre marquée à
l'iode 125 dans chaque tube. Vortexer.
Les laboratoires équipés d'un
pipeteur-dilueur fiable peuvent
procéder aux étapes 2 et 3
simultanément. Le temps d'addition du
traceur ne doit pas dépasser 10
minutes. Les tubes T peuvent être mis
de côté jusqu'au comptage (étape 6);
ils n'ont pas d'autre traitement.
4
32
Incuber 3 heures à 37°C.
5
Décanter complètement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision du dosage. A
l'aide d'un portoir de décantation,
décanter ou aspirer le contenu de tous
les tubes (excepté les tubes T) et
laisser les tubes retournés pendant 2
ou 3 minutes. Puis appliquer les
fortement sur du papier absorbant afin
d'éliminer les gouttelettes résiduelles.
pmol/l environ
Note: Les concentrations des
calibreurs sont spécifiques à chaque
lot. Se reporter aux étiquettes des
flacons pour obtenir les valeurs de T3
libre en pg/ml. Multiplier par 1,536
pour des pmol/l.
2
Ni étuve ni bloc chauffant ne sont
adaptés à ce dosage.
6
Compter 1 minute dans un compteur
gamma.
Calcul des résultats
Afin d'obtenir des résultats de T3 libre en
concentrations à partir d'une
représentation logit-log de la courbe de
calibration, calculer pour chaque paire de
tubes les coups corrigés : moyenne cpmmoyenne des cpm du LNS :
CPM corrigés = (Moyenne cpm) moins
(Moyenne cpm LNS)
Puis déterminer pour chaque paire la
capacité de liaison en pourcentage de
liaison maximale (MB), corrigée des cpm
dus au LNS des tubes A tubes considérés
à 100%:
% liaison = (cpm corrigés / cpm corrigés LM) ×
100
(Le calcul peut être simplifié en
négligeant la correction due au LNS. Les
échantillons dans la gamme de calibration
donnent des résultats pratiquement
identiques quand la capacité de liaison est
calculée directement à partir de la
moyenne des CPM.)
En utilisant un papier logit-log, on porte en
ordonnée les pourcentages de liaison en
fonction des concentrations des calibreurs
qui ne sont pas à zéro, en abscisse. On
trace une ligne droite passant
approximativement par ces points. Les
concentrations des échantillons inconnus
sont déterminées par interpolation sur la
courbe standard.
Il est bon de vérifier les paires et de
construire une représentation graphique
de la courbe de calibration (même si celleci est faite par ordinateur) avec les
différentes valeurs de façon à visualiser le
meilleur tracé et c'est une façon de
détecter les points déviants. Nous
recommandons aussi de suivre les
paramètres suivants :
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS /
cpm Totaux)
%LM = 100 × (cpm corrigés / cpm totaux)
Et les ordonnées à l'origine à 20, 50 et 80
% avec
neuf échantillons de patients
hyperthyroïdiens et 13 échantillons de
patients hypothyroïdiens ont également
été dosés, ainsi que des échantillons
prélevés sur des femmes enceintes au
cours du premier et du troisième
trimestres de leur grossesse. L'analyse de
ces échantillons avec ce coffret ont fourni
les résultats statistiques suivants :
Domaine de normalité
95%
20% = Concentration à 20% de liaison, etc.
Note: d'autres approches sont possibles
comme l'intégration de paramètres 4-p
logistique. Se rapporter à Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
n
pg/ml
pmol/l
405
1,4 – 4,4
2,2 – 6,8
Hyperthyroïdien
19
5,2 – 22,6*
8,0 – 35*
Hypothyroïdien
13
0,3 – 3,1*
0,5 – 4,8*
1er trimestre
17
2,1 – 4,7*
3,2 – 7,2*
3ème trimestre
20
1,7 – 4,6*
2,6 – 7,1*
Euthyroïdien
Grossesse
Exemple de série : A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série.
Comme les valeurs des calibreurs sont
spécifiques à chaque lot, les
concentrations indiquées peuvent être
différentes de celles mentionnées. (Voir le
tableau « Example Run ».)
*Domaine absolu de normalité
Euthyroïdien
Contrôle de qualité
Hyperthyroïdien
Les contrôles (ou groupes de sérum) avec
au moins deux taux de concentration de
T3 libre haut et bas doivent être dosés en
routine comme des échantillons inconnus.
Hypothyroïdien
Les résultats de patient ne doivent être
validés que si les résultats des contrôles
correspondent aux critères d'acceptation
établis par votre laboratoire.
Il est bon d'enregistrer pour chaque
dosage les numéros de lots des
composants utilisés ainsi que la date à
laquelle ils ont été reconstitués ou ouverts.
Nous recommandons également de noter
jour après jour les résultats des contrôles
– comme décrit par exemple dans
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Noter que le redosage d'échantillons
peut être précieux pour suivre la précision
inter essai, et que les paires de tubes
contrôle peuvent être espacées de façon
à vérifier l'absence de dérive significative.
Valeurs de référence
Des échantillons prélevés sur 405 adultes
euthyroïdiens ont été dosés à l'aide du
test Coat-A-Count T3 Libre (voir le
graphique à la fin de ce paragraphe.) DixCoat-A-Count Free T3 (PITKF3-8, 2010-10-22)
Médiane
pg/ml
pmol/l
405
2,8
4,3
19
9,2
14
13
0,6
0,9
1er trimestre
17
3,0
4,6
3ème trimestre
20
3,1
4,8
n
Grossesse
Utiliser ces valeurs à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire doit
établir ses propres valeurs de référence.
Limites
Le dosage de la T3 libre sert
principalement à confirmer
l'hyperthyroïdisme et n'a qu'une utilité très
limitée en cas d'hypothyroïdisme. Comme
indiqué dans le tableau « Expected
33
Values », la grande majorité des patients
atteints d'hyperthyroïdisme ont des taux
de T3 libres supérieurs à la normale, mais
cette méthode ne peut pas identifier
tous les cas d'hyperthyroïdie, car
l'intervalle hyperthyroïdien et l'intervalle
euthyroïdien peuvent se chevaucher en
partie.
L'interprétation des résultats de T3 libre
est rendue difficile par le nombre
important de médicaments pouvant
modifier la fixation de T3 sur les protéines
de transport.
En cas de pathologie grave non
thyroïdienne, le diagnostic thyroïdien est
rendu particulièrement difficile. En effet,
certains patients dans ce cas peuvent
souffrir d'une hypothyroïdie primaire
concomitante ou d'une hypothyroïdie
secondaire compensatrice. Dans ce
contexte, le dosage de TSH est
recommandé comme test de confirmation.
Dans de rares cas associés à des
variations très importantes de la capacité
de fixation de l'albumine —
dysalbuminémie hyperthyroxinémique
familiale (FDH) — les dosages directs
d'hormones thyroïdiennes libres peuvent
conduire à des résultats erronés
Les autoanticorps de T3 circulants et des
inhibiteurs de fixation des hormones
2,3,11
peuvent interférer sur le dosage.
Performances du test
Consulter les tableaux et graphiques pour
obtenir les données représentatives des
performances du test Coat-A-Count T3
Libre. Les résultats sont donnés en pg/ml.
En l'absence de précision supplémentaire,
tous les résultats ont été obtenus sur des
échantillons sériques.
Facteur de conversion :
Intervalle de linéarité : 0,5 – 42 pg/ml
(0,77 – 65 pmol/l) Les calibreurs sont
spécifiques à chaque lot.
Sensibilité analytique : 0,2 pg/ml
(0,31 pmol/l),
Précision intra-dosage (au sein d'une
même série) : la précision mesurée sur
des échantillons dosés en double est
illustrée dans le profil de précision, basé
sur 9 échantillons et 20 degrés de liberté
34
environ. (Se reporter au graphique «
Precision Profile ».)
Précision inter-dosage (entre plusieurs
séries) : les résultats ont été calculés
pour chacun des 3 échantillons à partir
des résultats de 20 séries en
duplicate.Les CV inter-dosage sont
donnés par des cercles vides (Voir le
tableau « Interassay Precision ».)
Effet de la position des tubes : aucun
jusqu'à 200 tubes. (Voir le tableau « Endof-Run Effect ».)
Spécificité : cet antisérum est hautement
spécifique pour la triiodothyronine. Les
réactivités croisées à poids égal à 50% de
liaison obtenues par le coffret Coat-ACount T3 Libre sont indiquées. (Voir le
tableau « Specificity ».)
Bilirubine : une concentration de 100 ou
200 mg/l a un effet insignifiant sur le
dosage. (Voir le tableau « Bilirubin ».)
Hémolyse : la présence de groupes
d'hématies concentrés jusqu'à 30 µl/ml n'a
aucun effet sur les résultats, dans les
limites de précision du dosage.
Autres types d'échantillons: pour
estimer l'effet de l'utilisation de différents
type d'échantillons, 32 volontaires ont été
prélevés sur tubes secs, héparinés et sur
tubes vacutainer EDTA. Tous les
échantillons ont été dosés avec le
protocole Coat-A-Count T3 Libre et ont
donné les résultats suivants.
Médiane pg/ml
Sérum
Hépariné
EDTA
3,4
2,9
2,7
Sur la base de ces résultats, il est
recommandé de collecter des échantillons
sériques.
Interaction de l'albumine : pour procéder
au dosage de la T3 libre par compétition, il
est essentiel que l'analogue de la T3
marqué à un ligand ne se lie pas à une
protéine de transport endogène, comme la
TBG et l'albumine. Des variations du taux
d'albumine circulant ont modifié de
manière significative certaines techniques
24
de dosage de la T3 libre par compétition.
L'expérience suivante a démontré
l'absence d'effet des variations des taux
d'albumine sur les dosages avec le coffret
Coat-A-Count T3 Libre : 5 échantillons de
femmes au 3ième trimestre de grossesse,
ont été divisés en 4 aliquotes,
surchargées en albumine humaine filtrée
sur charbon de bois (CAHSA) à 0, 10, 20
et 50 mg/ml) puis analysés en duplicate
avec cette technique ; la valeur moyenne
de chaque concentration en albumine
(n = 5) a été portée en fonction de la
concentration apparente de T3 libre : il est
évident que les résultats de T3 libre ne
sont pas affectés par l'addition d'albumine
jusqu'à 5,0 g/dl, soit une concentration
totale de 8,0 g/dl. (Voir le graphique
« Bilirubin ».)
Interaction des acides gras non
estérifiés : pour estimer l'interaction des
acides gras non estérifiés avec la
technique Coat-A-Count T3 Libre, l'acide
oléïque appartenant à cette famille a été
ajouté à différentes concentrations sur 4
échantillons : ces solutions ont été
analysées avec le coffret Coat-A-Count T3
Libre, une moyenne des résultats pour ces
4 échantillons a été calculée, le tableau
montre que même de fortes teneurs en
acides gras libres circulant n'ont pas
d'influence sur le dosage Coat-A-Count T3
Libre. Des taux élevés d'acides gras libres
se retrouvent dans de nombreuses
situations telles les fins de grossesse, des
thérapies sous héparine etc. (Voir le
tableau « Effect of Nonesterified Fatty
Acids ».)
(Toxicité: au-delà de 30 mg/dl.) Ces
échantillons ont été analysés avant et
après surcharge avec le dosage Coat-ACount T3 Libre : les résultats démontrent
l'absence d'effet des salicylates. (Voir le
tableau « Effect of Salicylate ».)
Interaction de la TBG: afin de déterminer
si la TBG (Thyroid Binding Globulin) peut
lier l'analogue-traceur du coffret
Coat-A-Count Free T3. Une préparation
de TBG libre de toute T3 apparente a été
additionnée au calibreur zéro à des
concentrations de 0, 1, 2 et 5 g/dl. Ces
solutions ont été analysées avec la
technique Coat-A-Count Free T3 : si
l'analogue liait la TBG, moins de traceur
reste disponible pour l'anticorps, les taux
de liaison (%B/B0) obtenus démontrent
que l'analogue-traceur ne se lie pas avec
la TBG. (Voir le tableau « Effect of
TBG ».)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Interaction de la phénytoïne : des
échantillons de patients ont été
surchargés avec 50 µg/ml de phénytoîne.
(Toxicité: au-delà de 25 µg/ml.) Ces
échantillons ont été analysés avant et
après surcharge avec le dosage Coat-ACount T3 Libre : ces résultats indiquent
que la phénytoïne à une concentration de
10 µg/ml et plus a un effet cliniquement
significatif sur le dosage Coat-A-Count T3
Libre. (Voir le tableau « Effect of
Phenytoin ».)
Italiano
Interaction de la phénylbutazone : des
surchargés avec 1 000 µg/dl de
phénylbutazone. (Toxicité: au-delà de
20 µg/dl.) Ces échantillons ont été
analysés avant et après surcharge avec le
dosage Coat-A-Count T3 Libre : les
résultats démontrent l'absence d'effet de
la phénylbutazone sur ce dosage. (Voir le
tableau « Effect of Phenylbutazone ».)
Il kit da 100 determinazioni
contiene meno di 4,5 microcurie
(167 kilobecquerel) di analogo
125
della T3 marcato con I .
Interaction des salicylates : des
surchargés avec 100 mg/dl de salicylates
Uso: Il dosaggio Coat-A-Count T3 Libera
è un radioimmunodosaggio in fase solida
per la determinazione quantitativa dei
livelli di T3 libera nel siero. A solo uso
diagnostico in vitro quale ausilio nella
determinazione clinica dello stato tiroideo.
Codice: TKF31 (100 provette)
Riassunto e Spiegazione del
Test
In condizioni fisiologiche normali la
triiodotironina (T3) rappresenta circa il 5%
degli ormoni tiroidei nel plasma. Benché
presente in concentrazioni inferiori alla
tiroxina (T4), la T3 ha un'attività
metabolica maggiore, un turnover più
35
veloce ed un volume di distribuzione più
ampio. Viene prodotta in gran parte
attraverso la conversione extratiroidea
della T4. Siccome la T4 circola quasi
interamente legata alle proteine carrier
TBG, pre-albumina ed albumina, la T3
Libera costituisce solo circa lo 0,25% della
T3 totale in circolo.
Le determinazioni di T3 totale attraverso
immunodosaggio presentano un buon
numero di utilizzi ben stabiliti. Vengono
sovente utilizzate quale ausilio nella
conferma di una diagnosi di ipertiroidismo
laddove è stato riscontrato un livello
elevato di T4 libera o totale. Livelli
eccessivamente elevati di T3 totale
possono anche verificarsi nel contesto di
una T4 totale normale – una condizione
nota come “Tossicosi da T3”.
Per la maggior parte, i livelli di T3 libera
correlano strettamente con i livelli di T3
totale. La T3 totale, tuttavia, è in funzione
non solo dello stato tiroideo e della
conversione periferica della T4 in T3, ma
anche della concentrazione di proteine
leganti gli ormoni tiroidei. La T3 Libera,
d'altro canto, non viene intaccata dalle
variazioni in queste proteine carrier.
Quindi, gli aumenti nella TBG tipici della
gravidanza, dell'assunzione di
contraccettivi orali e della terapia
estrogenica indurranno un aumento nel
livello di T3 totale, lasciando
sostanzialmente immutata la
concentrazione di T3.
Tipicamente, le concentrazioni di T3 libera
rifletteranno lo stato tiroideo reale del
paziente in modo più affidabile rispetto
alle concentrazioni di T3.
Procedura del Dosaggio
Il dosaggio Coat-A-Count T3 Libera è un
radioimmunodosaggio in fase solida, dove
125
l'analogo della T3 marcato con I
compete per un tempo prefissato con la
T3 libera presente nel campione del
paziente per i siti sugli anticorpi T3
specifici. Poiché l'anticorpo è adeso alle
pareti di una provetta di polipropilene, la
semplice decantazione del supernatante è
sufficiente per terminare la competizione e
per isolare la frazione legata all'anticorpo
della T3 libera radiomarcata. La conta
della provetta in un gamma counter
produce un numero inversamente
36
proporzionale alla concentrazione di T3
libera presente nel campione.
Il Dosaggio Coat-A-Count T3 Libera è un
9
dosaggio diretto o a provetta singola nel
senso che i risultati non sono calcolati in
funzione della T3 totale, ma interpolati
dalla curva di calibrazione calibrata in
concentrazioni di T3 libera. A questo
proposito differisce dai metodi classici di
dialisi di equilibrio e dalle cosiddette
determinazioni dell'Indice di T3 libera. Si
tratta anche di un dosaggio a stadio
singolo, che non richiede né preincubazione, né isolamento preliminare
della frazione libera attraverso dialisi o
cromatografia a colonna.
Il Sistema Coat-A-Count T3 Libera è stato
ottimizzato per eliminare tutti i legami del
tracciante analogo della T3 dalle proteine
endogene, lasciando indisturbato
l'equilibrio originario tra la T3 libera e
quella legata alle proteine presenti nel
campione. Il tracciante stesso non ha
affinità misurabile per la TBG, la principale
proteina di trasporto degli ormoni tiroidei.
Per evitare che il tracciante si leghi
all'albumina, sono presenti degli agenti
bloccanti ad una concentrazione
attentamente calibrata per evitare la
dislocazione della T3 nativa dalle proteine
carrier endogene. Per minimizzare
ulteriormente il rischio di “stripping”, il
sistema utilizza un anticorpo, a bassa
concentrazione, con affinità per la T3 di
poco inferiore a quella della TBG, ed
opera a condizioni fisiologiche di
temperatura, pH e forza ionica.
Nessun Artifatto Legato all'Albumina: Il
sistema Siemens Healthcare Diagnostics
basato sull'analogo della T3 libera si
distingue per l'utilizzo di una
concentrazione efficace, ed
adeguatamente ottimizzata di agenti
albumina-bloccanti. Ciò elimina gli artifatti
che si ritrovano abbastanza di sovente in
altri metodi basati sull'analogo e disponibili
in commercio in corrispondenza del terzo
trimestre di gravidanza, patologie non
tiroidee e terapia con eparina – condizioni
che comportano livelli anomali di albumina
e/o acidi grassi liberi. (Per una
discussione completa su questo aspetto,
vedi gli articoli di Witherspoon, El Shami,
24
et al. Informazioni di Base possono
essere ritrovate nella monografia AlbuminRelated Artifacts in Free Thyroid Hormone
Assays, disponibile presso Siemens
Healthcare Diagnostics).
Acqua: Utilizzare acqua distillata o
deionizzata.
Valori Attesi: Il range di riferimento
consigliato di 1,4–4,4 pg/mL
(2,2–6,8 pmol/L) è in correlazione
sostanziale con i moderni metodi di
riferimento, vedi radioimmunodosaggi
diretti per la T3 totale nei dializzati sierici.
La capacità del dosaggio Coat-A-Count
T3 libera di discriminare tra campioni
ipertiroidei e controlli eutiroidei è stata
studiata intensamente su campioni
clinicamente confermati. L'accuratezza è
stata ulteriormente verificata su campioni
di donne in gravidanza e su campioni di
pazienti non affetti da patologie tiroidee.
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Reagenti da Dispensare: 1
Tempo Totale di Incubazione: 3 ore a
37°C
Conte Totali alla Iodinazione:
circa 60 000 cpm
Avvertenze e Precauzioni
Ad uso diagnostico in vitro.
Reagenti: conservare a 2-8°C in un
frigorifero adibito al materiale radioattivo.
Eliminare secondo le disposizioni di legge
vigenti.
Non utilizzare reagenti oltre la loro data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale umano e/o
altri ingredienti potenzialmente pericolosi
che necessitano di alcune precauzioni.
Seguire le precauzioni universali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati dosati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli anticorpi Anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B;
e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. Le licenze
generiche (possessori di NRC Form 483)
possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi
come non radioattivi, dopo aver rimosso
l'etichetta. I detentori di autorizzazioni
specifiche (NRC Form 313) devono fare
riferimento al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
37
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
I calibratori ricostituiti hanno valori di T3
libera lotto-specifici di circa 0, 0,5, 1,6, 3,5,
7,0, 21 e 42 picogrammi di T3 libera per
millilitro (pg/mL); equivalenti a circa 0,
0,77, 2,5, 5,4, 11, 32 e 65 picomoli per
litro (pmol/L). Fare riferimento alle
etichette dei flaconi per i valori esatti in
pg/mL. Per convertire in pmol/L,
moltiplicare per 1,536.
Materiali Forniti:
Preparazione Iniziale
Vortex mixer.
Attenzione che i materiali forniti in questo
kit non sono interscambiabili con quelli del
kit Coat-A-Count T3 Totale
Preparazione dei Reagenti
Cilindro graduato: 110 mL
Provette Coattate con un Anticorpo T3
Libera (TF31)
Provette di polipropilene coattate con
anticorpi anti-triiodotironina (T3) e
confezionate in buste a cerniera.
Conservare refrigerate al riparo
dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo.
Stabili a 2–8°C fino alla data di scadenza
indicata sulla confezione.
Colore: acquamarina.
TKF31: 100 provette.
125
T3 Libera marcata con I (TF32)
Tracciante liofilo, composto da l'analogo
della T3 iodinato. Ricostituire ciascun
flacone aggiungendo 110 mL di acqua
distillata o deionizzata. Lasciar riposare
per 10 minuti, quindi mescolare
capovolgendo la provetta. Stabile a 2–8°C
per 30 giorni dopo la ricostituzione o fino
alla data di scadenza indicata sul flacone.
TKF31: 1 flacone.
mescolare scuotendo leggermente.
Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo la
ricostituzione.
TKF31: 1 set.
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter — compatibile con
provette standard da 12x75 mm.
Pipette volumetriche: 1,0 e 2,0 mL
Acqua distillata o deionizzata
Radioimmunodosaggio
Provette semplici di polipropilene da
12×75 mm — da utilizzarsi come provette
NSB, disponibili presso Siemens
Healthcare Diagnostics (Codice: PPO).
Micropipette: da 100 µL e da 1 000 µL
Bagnetto ad acqua — in grado di
mantenere una temperatura di 37°C. Non
utilizzare né forni né piastre riscaldate.
Foam per la decantazione — disponibili
presso Siemens Healthcare Diagnostics
(Codice: FDR).
Carta per grafici logit-log
Controlli. Un controllo a tre-livelli, basato
su siero umano, contenente T3 libera tra
gli altri 25 costituenti dosati, disponibile da
Siemens Healthcare Diagnostics (codice:
CON6).
Prelievo dei Campioni
Calibratori T3 Libera T3 (F3C3–9)
Sette flaconi di siero umano processato e
liofilo, etichettati dalla A alla G. Almeno 30
minuti prima dell'utilizzo, ricostituire il
calibratore zero A con 2,0 mL di acqua
distillata o deionizzata, e ciascuno dei
calibratori rimanenti dalla B alla G con
1,0 mL di acqua distillata o deionizzata.
Utilizzare pipette volumetriche e
38
Non occorre che il paziente sia a digiuno,
e non sono necessarie preparazioni
25
particolari. Effettuare il prelievo in
provette semplici e separare il siero dalle
cellule attraverso centrifugazione.
E' stato riscontrato che l'eparina ha sia
effetti in vivo che in vitro sugli ormoni
8
tiroidei liberi, quindi, i campioni non
devono essere prelevati durante o subito
dopo la somministrazione di
anticoagulanti.
coattate con anticorpo, anch'esse in
duplicato, per i controlli ed i campioni.
I campioni lipemici, itterici o
grossolamente contaminati possono
produrre risultati errati. Si consiglia
l'utilizzo di un'ultracentrifuga per schiarire i
campioni lipemici.
Calibratori
Campioni emolizzati possono indicare un
trattamento non idoneo dei campioni
prima dell'arrivo al laboratorio; quindi i
risultati devono essere interpretati con
cautela.
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
L'Coat-A-Count T3 Libera non é stato
verificato con tutte le possibili variazioni di
tipi di provette. Consultare la sezione
riguardante Campioni Alternativi per
dettagli sulle provette testate.
2
Prima del dosaggio, consentire ai
campioni di raggiungere temperatura
ambiente (15–28°C) e mescolare
capovolgendo la provetta. Aliquotare, se
necessario, per evitare ripetuti cicli di
congelamento e scongelamento. Non
tentare di scongelare campioni congelati
riscaldandoli in un bagno ad acqua.
3
0
0,5
0,77
C
1,6
2,5
D
3,5
5,4
E
7,0
11
F
21
32
G
42
65
Dispensare 100 µL del calibratore
zero A e 100 µL di ciascuno dei
calibratori, controlli e campioni
rimanenti nelle provette preparate.
Dispensare direttamente al fondo.
Aggiungere 1,0 mL di T3 Libera
125
marcata con I ad ogni provetta.
Vortexare.
Laboratori forniti di un pipettatorediluitore affidabile possono gestire i
punti 2 e 3 simultaneamente, occorre
fare attenzione ad evitare il carryover
da una provetta all'altra. Non devono
trascorrere più di 10 minuti durante la
dispensazione del tracciante. Mettere
da parte le provette T per la conta (al
punto 6); non richiedono ulteriore
processazione.
Provette Semplici: Etichettare con T
quattro provette semplici (non
coattate) da 12x75 mm di
polipropilene (conte totali) ed NSB
(legame nonspecifico) in duplicato.
Provette Coattate: Etichettare con A
quattordici provette coattate con Anticorpo
T3 Libera (legame massimo) e dalla B alla
G in duplicato. Etichettare altre provette
0
B
Si consiglia di utilizzare una
micropipetta monouso, cambiando il
puntale tra i campioni, per evitare la
contaminazione da carryover.
Tutti i componenti devono essere portati a
temperatura ambiente (15-28°C) prima
dell'utilizzo.
Poiché il legame non specifico nel
dosaggio Coat-A-Count è
caratteristicamente basso, le provette
NSB possono essere omesse senza
compromettere l'accuratezza o il
controllo di qualità.
A (MB)
Non tentare di diluire i campioni con
concentrazioni attese elevate nel
calibratore zero. (Poiché la diluizione
sposta l'equilibrio tra la T3 libera e
quella legata, non ci si può attendere
che il dosaggio mantenga la linearità
durante la diluizione).
Conservazione: 2 giorni a 2–8°C, o fino a
2 mesi congelato a –20°C.
1
Circa pmol/L
Nota: I valori dei calibratori sono lottospecifici. Fare riferimento alle etichette
dei calibratori per valori in pg/mL. Per
la conversioni in pmol/L, moltiplicare
per 1,536.
Volume Richiesto: 100 µL di siero per
provetta.
Radioimmunodosaggio
Circa pg/mL
4
Incubare per 3 ore a 37°C.
Utilizzare un bagnetto ad acqua; non
utilizzare né un forno né una piastra
riscaldata.
5
Decantare completamente.
39
La rimozione di tutta l'umidità residua
aumenterà molto la precisione. Con
l'utilizzo di un foam per la
decantazione, decantare il contenuto
di tutte le provette (ad eccezione delle
provette T) e consentire loro di
asciugarsi per 2 o 3 minuti. Blottare le
provette su carta assorbente per
eliminare le goccioline residue.
6
Contare per 1 minuto in un gamma
counter.
della trasformazione utilizzata e per
individuare i punti devianti della
calibrazione. Consigliamo anche di
annotare questi parametri per il calcolo dei
dati:
T = Conte Totali (conte al minuto)
%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)
E le "intercette" al 20, 50 ed 80%, dove
20% = Concentrazione al 20% di Legato ecc.
Calcolo dei Risultati
Per ottenere risultati in termini di
concentrazione da una rappresentazione
logit-log della curva di calibrazione,
calcolare inizialmente per ogni coppia di
provette la conte medie per minuto
corrette con NSB:
Nota: sono accettabili anche altri approcci,
i.e. implementazione della logistica a 4
parametri. Vedi Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
Quindi determinare il legame di ogni
coppia di provette come percentuale del
legame massimo (MB) con le conte
corrette con NSB delle provette A prese al
100%:
Seduta Esemplificativa: A solo scopo
illustrativo e non per il calcolo dei risultati
di un'altra seduta. Poiché i valori dei
calibratori sono lotto-specifici, le
concentrazioni elencate nella colonna più
a destra possono non essere
sovrapponibili ai valori dei calibratori forniti
nella spedizione. (Vedi tabella "Example
Run".)
Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte
Nette MB) × 100
Controllo di Qualità
Conte Nette = (Media dei CPM) Meno (Media
CPM NSB)
(Il calcolo può essere semplificato
omettendo la correzione per il legame non
specifico; campioni entro il range dei
calibratori possono produrre virtualmente
gli stessi risultati se la Percentuale di
Legato viene calcolata direttamente dai
CPM Medi.)
Utilizzando una carta per grafici logit-log,
tracciare la Percentuale di Legato
sull'asse verticale (probabilità) vs. la
Concentrazione sull'asse orizzontale
(logaritmica) per ciascuno dei calibratori
nonzero, e tracciare una curva
approssimativamente lungo questi punti.
(Collegare i punti della calibrazione con
archi o linee rette. Non tentare di
congiungere i punti con un'unica retta). Le
concentrazioni per i controlli ed i campioni
non noti entro il range dei calibratori non
zero possono essere stimate dalla curva
di calibrazione per interpolazione.
E' buona norma verificare i risultati della
correlazione entro i replicati e costruire un
grafico della curva di calibrazione (anche
se i calcoli vengono gestiti dal computer)
quale verifica visiva sull'appropriatezza
40
Controlli (o pool di siero) con almeno due
livelli di concentrazione di T3 libera –
basso ed alto – dovrebbero essere dosati
di routine come campioni non noti.
Riportare i risultati solo se i risultati dei
controlli incontrano i criteri stabiliti dal
Vostro laboratorio riguardo all'accettabilità.
E' buona norma riportare per ogni
dosaggio i numeri di lotto dei componenti
utilizzati, cosiccome le date della prima
ricostituzione o apertura. Raccomandiamo
anche di tracciare i risultati dei controlli di
giorno in giorno – come descritto, ad
esempio, in Westgard JO, et al. A multirule chart for quality control. Clin Chem
1981;27:493-501. Notare che campioni
ripetuti possono servire quale ulteriore
strumento per il monitoraggio della
precisione interdosaggio, e che coppie di
provette di controllo possono essere
intervallate lungo il dosaggio per aiutare
nella verifica dell'assenza di slittamenti
significativi.
Valori Attesi
Campioni di siero di 405 adulti eutiroidei
sono stati dosati con il dosaggio Coat-ACount T3 Libera (vedi il paragrafo alla fine
di questa sezione). Sono stati dosati
anche campioni provenienti da 19 pazienti
ipertiroidei a da 13 pazienti ipotiroidei,
cosiccome campioni di donne nel primo e
nel terzo trimestre di gravidanza. L'analisi
dei risultati di T3 libera di questi campioni
ha prodotto le seguenti statistiche.
Range Centrale 95%
n
pg/mL
pmol/L
405
1,4 – 4,4
2,2 – 6,8
Ipertiroidei
19
5,2 – 22,6*
8,0 – 35*
Ipotiroidei
13
0,3 – 3,1*
0,5 – 4,8*
1° Trimestre
17
2,1 – 4,7*
3,2 – 7,2*
3° Trimestre
20
1,7 – 4,6*
2,6 – 7,1*
Eutiroidei
Gravidanza
*Range Assoluto
Valore Mediano
n
pg/mL
pmol/L
Eutiroidei
405
2,8
4,3
Ipertiroidei
19
9,2
14
Ipotiroidei
13
0,6
0,9
1° Trimestre
17
3,0
4,6
3° Trimestre
20
3,1
4,8
Gravidanza
Considerare questi limiti solo come linee
guida. Ciascun laboratorio dovrebbe
stabilire i propri range di riferimento.
Come indicato nella tabella Valori Attesi,
la gran maggioranza dei pazienti con
ipertiroidismo avrà volori di T3 libera che
eccedono il limite superiore di normalità;
ma non tutti questi pazienti possono
essere identificabili in questo modo,
poiché potrebbe esserci una
sovrapposizione tra il range degli
eutiroidei e quello degli ipertiroidei.
L'interpretazione dei risultati di T3 libera è
complicata da una varietà di farmaci che
possono intaccare il legame della T3 con
le proteine carrier degli ormoni tiroidei.
In patologie gravi non tiroidee, la
determinazione dello stato tiroideo diventa
particolarmente difficile. Poiché alcuni
pazienti in questa categoria possono
soffrire di ipotiroidismo primario
concomitante o di ipotiroidismo
compensatorio secondario, gli
immunodosaggi del TSH sono stati
consigliati come test di conferma in questo
contesto.
In rare condizioni associate con variazioni
estreme nella capacità legante
dell'albumina – quali ipertirossinemia
disalbuminemica familiare (FDH) –
dosaggi diretti degli ormoni tiroidei
possono produrre risultati fuorvianti.
Gli autoanticorpi anti-T3 nel circolo, e gli
inibitori dei legami ormonali, possono
2,3,11
interferire con il dosaggio.
Prestazioni del Dosaggio
Vedi Tabelle e Grafici per dati
rappresentativi delle prestazioni del
Dosaggio Coat-A-Count T3 Libera. I
risultati di T3 Libera nelle sezioni di cui di
seguito sono espressi in pg/mL. Se non
diversamente specificato, tutti i risultati
sono stati generati da campioni di siero.
Fattore di Conversione:
pg/mL × 1,536 → pmol/L
Range di Calibrazione: 0,5 – 42 pg/mL
(0,77 – 65 pmol/L) I calibratori sono
lotto-specifici.
Sensibilità Analitica: 0,2 pg/mL
(0,31 pmol/L),
Limiti
Il dosaggio della T3 Libera serve
principalmente come test di conferma per
l'ipertiroidismo ed è di utilizzo molto
limitato nel contesto dell'ipotiroidismo.
Precisione Intra-dosaggio (IntraSeduta): La precisione per campioni
dosati in duplicato è graficamente
riassunta nel profilo di precisione, basato
su nove campioni e circa venti gradi di
libertà. (Vedi grafico “"Precision Profile").
41
Precisione Inter-dosaggio (Da una
seduta all'altra): Sono state calcolate
statistiche per ciascuno dei tre campioni
dai risultati di coppie di provette in 20
dosaggi diversi. (Vedi tabella
"Interassay".)
Effetto Fine Seduta: nessuno fino a circa
200 provette. (Vedi tabella "End-of-Run
Effect".)
Specificità: L'antisiero è altamente
specifico per la triiodotironina. Nella
tabella “Specificity” sono illustrate le
crossreattività relative (su base peso/peso
al 50% del legame) ottenute con il
dosaggio Coat-A-Count T3 Libera. (Vedi
tabella "Specificity".)
Bilirubina: Livelli di 100 o 200 mg/L
hanno un effetto marginale sul dosaggio.
(Vedi tabella "Bilirubina".)
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni superiori a
30 µL/mL non ha effetto su risultati, entro
il range di precisione del dosaggio.
Tipo di Campione Alternativo: Per
determinare l'effetto di campioni
alternativi, è stato prelevato del sangue da
32 volontari in provette semplici,
eparinizzate e EDTA vacutainer. Tutti i
campioni si sono analizzati mediante il
procedimento di T3 Libera
dell'Coat-A-Count, con i risultati seguenti.
Siero
Media pg/mL
3,4
Eparina
EDTA
2,9
2,7
Sulla base di questo studio, si consiglia di
prelevare i campioni come siero.
Effetto dell'Albumina: Perché un
dosaggio della T3 basato sull'analogo
abbia successo, è fondamentale che il
tracciante dell'analogo non si leghi alle
proteine di trasporto endogene, inclusa la
TBG e l'albumina. Metodi analoghi
precedenti per la T3 libera sono stati
intaccati in maniera significativa dalle
variazioni nel livello di albumina
24
circolante. L'esperimento di seguito
presentato è stato concepito per
dimostrare che le variazioni nel livello di
albumina non hanno effetto sul dosaggio
Coat-A-Count T3 libera. Cinque campioni
di donne nel terzo trimestre di gravidanza
sono stati ciascuno diviso in quattro
aliquote. Albumina sierica umana
assorbita con carbone vegetale (CAHSA)
42
è stata aggiunta in concentrazioni di 0, 10,
20 e 50 mg/mL, e le quattro aliquote sono
state quindi dosate in duplicato con il
dosaggio Coat-A-Count T3 Libera. Il
valore medio per ciascuna concentrazione
di albumina (n=5) è stata quindi tracciata
vs. la concentrazione apparente di T3
libera. E'evidente dai dati che i risultati
non sono stati intaccati dall'aggiunta di
albumina fino a 5,0 g/dL, per una
concentrazione totale di albumina di circa
8,0 g/dL. (Vedi grafico “"Effect of
Albumin")
Effetto degli Acidi Grassi Non
esterificati: Per determinare se gli acidi
grassi liberi (non esterificati) interferiscano
con il dosaggio Coat-A-Count T3 Libera,
l'acido oleico – un membro
rappresentativo di questa famiglia – è
stato aggiunto a varie concentrazioni in
ciascuno dei 4 campioni. Tutti i campioni
sono stati dosati con il dosaggio
Coat-A-Count T3 Libera. E' stata fatta la
media dei risultati per i quattro campioni.
Livelli aumentati di acidi grassi liberi si
incontrano in una varietà di situazioni
incluse gravidanze tardive e terapia con
eparina. La tabella mostra che il dosaggio
Coat-A-Count T3 Libera è essenzialmente
non intaccato persino da aumenti
importanti nel livello di acidi grassi liberi
nel circolo. (Vedi tabella "Effect of
Nonesterified Fatty Acids")
Effetto della Fenitoina: Ai campioni dei
pazienti sono stati aggiunti fino a
50 µg/mL di Fenitoina (Tossica: al di sopra
di 25 µg/mL.) I campioni sono stati dosati
diluiti e non con il Dosaggio Coat-A-Count
T3 Libera, i risultati sono di seguito
tabulati. I risultati mostrano che a livelli di
10 µg/mL e oltre, la fenitoina non ha un
effetto clinicamente significativo sul
dosaggio Coat-A-Count T3 Libera. (Vedi
tabella "Effect of Phenytoin").
Effetto del Fenilbutazone: A campioni di
siero sono stati aggiunti fino a 1 000 µg/dL
di fenilbutazone (Tossico: al di sopra di
20 µg/dL.) I campioni sono stati dosati,
diluiti e non con il Dosaggio Coat-A-Count
T3 Libera, i risultati sono di seguito
tabulati. I risultati mostrano che il
fenilbutazone non ha nessun effetto in
vitro sul dosaggio Coat-A-Count T3 Libera
(Vedi tabella "Effect of Phenylbutazone".)
Effetto del Salicilato: Ai campioni sono
stati aggiunti fino a 100 mg/dL di salicilato
(Tossico: al di sopra di 30 mg/dL.) I
campioni sono stati dosati diluiti e non con
il dosaggio Coat-A-Count T3 Libera. I
risultati mostrano che il salicilato non ha
nessun effetto in vitro sul dosaggio
Coat-A-Count T3 Libera. (Vedi tabella
"Effect of Salicylate".)
Effetto della TBG: Per determinare se
l'ormone legante la tiroide (TBG) legherà il
tracciante dell'analogo, è stato condotto il
seguente esperimento utilizzando il
125
tracciante dell'analogo marcato con I dal
kit Coat-A-Count T3 Libera. TBG privata
con l'uso della resina di tutta la T3
apparente è stata aggiunta al calibratore
zero a concentrazioni di 0, 1, 2 e 5 g/dL.
Questi campioni sono stati processati con
la procedura Coat-A-Count T3 Libera. Se
in grado di legarsi alla TBG, un
quantitativo inferiore di tracciante
dell'analogo si legherà all'anticorpo adeso.
I valori osservati di Percentuale di Legato
(%B/B0) descritti in tabella indicano che il
tracciante non si lega alla TBG. (Vedi
tabella "Effect of TBG").
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
Português
Utilização: O Coat-A-Count Free T3 é um
radioimunoensaio de fase sólida
125
I concebido para a medição quantitativa
dos níveis de T3 livre no soro. Destina-se
estritamente ao uso de diagnóstico in vitro
como auxiliar na avaliação clínica da
função tiroideia.
Números de Catálogo: TKF31 (100 tubes)
O kit de 100 tubos contém menos
de 4,5 microcuries (167
quilobecquerels) de análogo
125
radioactivo T3 I.
Sumário e Explicação do Teste
Em condições fisiológicas normais, a triiodotironina (T3) representa
aproximadamente 5% da hormona
tiroideia no plasma. Embora esteja
presente em concentrações inferiores à
tiroxina (T4), a T3 apresenta uma
actividade metabólica superior, uma
transferência mais rápida e um maior
volume de distribuição. É em grande parte
produzida através da conversão
extratiroidal da T4. À semelhança da T4,
circula quase na sua totalidade ligada às
proteínas transportadoras TBG, préalbumina e albumina. A T3 livre constitui
apenas cerca de 0,25% da T3 total em
circulação.
A medição da T3 total por imunoensaio
apresenta uma série de utilizações
comprovadas. É frequentemente utilizada
como auxiliar na confirmação do
diagnóstico de hipertiroidismo, em caso
de detecção de níveis elevados de T4
livre ou total. Aumentos anormais na T3
total podem também registar-se com
níveis normais de T4 total – a denominada
“toxicose de T3”.
Na sua maior parte, os níveis de T3 livre
estão estreitamente correlacionados com
os níveis de T3 total. O nível de T3 total,
no entanto, varia em função não só da
função da tiroideia e da conversão
periférica de T4 para T3, mas também da
concentração das proteínas de ligação da
hormona tiroideia. A T3 livre, por outro
lado, permanece substancialmente
inalterada relativamente às variações
nestas proteínas transportadoras. Assim,
os aumentos de TBG típicos do estado de
gravidez, uso de contraceptivos orais e
terapêutica com estrogénios, provocam
um aumento no nível de T3 total,
mantendo-se a concentração de T3 livre
basicamente inalterada.
Tipicamente, as concentrações de T3 livre
reflectem a função tiroideia real do
paciente de uma forma mais fiável do que
as concentrações de T3 total.
Princípio do Procedimento
O procedimento Coat-A-Count Free T3 é
um radioimunoensaio de fase sólida em
125
que o análogo T3 marcado com I
concorre durante um período de tempo
determinado com a T3 livre nas amostras
de paciente por locais de fixação no
43
anticorpo específico de T3. Uma vez que
o anticorpo fica imobilizado na parede no
tubo de polipropileno, basta decantar
simplesmente o sobrenadante para
terminar esta competição e isolar a
fracção ligada do anticorpo da T3 livre
marcada radioactivamente. Contar o tubo
num contador gama produz então um
número inversamente relacionado com a
concentração de T3 livre presente na
amostra de paciente.
O procedimento Coat-A-Count Free T3 é
9
um ensaio de tubo simples ou directo, no
sentido limitado em que os seus
resultados não são calculados em função
da T3 total, mas sim interpolados a partir
de uma curva de calibração calibrada em
concentrações de T3 livre. Neste aspecto,
difere dos métodos clássicos de diálise de
equilíbrio, bem como das chamadas
medições por índice de T3 livre. Trata-se
também de um ensaio de
fase única, que não requer nem uma fase
de pré-incubação nem um isolamento
prévio da fracção livre por diálise ou
cromatografia por colunas.
O sistema Coat-A-Count Free T3 foi
optimizado a fim de eliminar toda a
ligação do marcador análogo de T3 às
proteínas endógenas, mantendo
essencialmente inalterado o equilíbrio
original entre a T3 livre e a T3 ligada às
proteínas na amostra de paciente. O
marcador propriamente dito não tem
qualquer afinidade mensurável
relativamente à globulina de ligação à
tiróide (TBG), a principal proteína
transportadora de hormona tiroideia. A fim
de prevenir a ligação do marcador à
albumina, estão presentes agentes
bloqueadores, numa concentração
cuidadosamente ajustada para evitar a
deslocação da T3 nativa a partir das
proteínas transportadoras endógenas.
Para minimizar ainda mais o risco de
"stripping," o sistema utiliza um anticorpo,
a uma baixa concentração, com uma
afinidade relativamente à T3 ligeiramente
inferior à da TBG, e que actua sob
condições fisiológicas de temperatura, pH
e força iónica.
Artefactos Não Relacionados com
Albumina: O sistema de T3 livre do
método de análogo da Siemens
Healthcare Diagnostics distingue-se pela
sua utilização de uma concentração eficaz
e optimizada de forma adequada dos
44
agentes bloqueadores da albumina. Isto
elimina os artefactos muitas vezes
observados noutros métodos de análogo
disponíveis no mercado relacionados com
o terceiro trimestre da gravidez, doenças
não tiroideias e terapêutica com heparina
– condições que envolvem níveis
anormais de albumina e/ou ácidos gordos
livres. (Para uma discussão abrangente
desta questão, ver os artigos de
24
Witherspoon, El Shami, et al. Informação
genérica encontra-se disponível na
monografia Albumin-Related Artifacts in
Free Thyroid Hormone Assays, disponível
na Siemens Healthcare Diagnostics.)
Valores Previstos: A gama de referência
recomendada de 1,4–4,4 pg/mL
(2,2–6,8 pmol/L) apresenta uma
substancial concordância com os métodos
de referência modernos, isto é,
radioimunoensaios directos para T3 livre
em dialisados do soro. A capacidade do
kit Coat-A-Count Free T3 para distinguir
amostras de hipertiróide de controlos de
eutiróide, tem sido extensivamente
testada em amostras confirmadas
clinicamente. A sua precisão foi ainda
verificada em amostras de casos de
gravidez e amostras de pacientes com
doenças não tiroideias.
Reagentes para Pipetar: 1
Tempo Total de Incubação: 3 horas a
37°C
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: aproximadamente 60 000 cpm
Avisos e Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado a materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com as
leis aplicáveis.
Não utilizar os reagentes para além dos
prazos de validade.
Alguns componentes fornecidos com este
kit podem conter matéria de origem
humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções
Seguir as precauções universalmente
aplicáveis, e manusear todos os
componentes como possíveis
transmissores de agentes infecciosos. Os
materiais de origem, derivados de sangue
humano, foram testados e considerados
como não reactivos à sífilis; aos
anticorpos de HIV 1 e 2; ao antigénio
superficial da hepatite B; e aos anticorpos
da hepatite C.
Tem sido adicionada, como conservante,
azida de sódio em concentrações
inferiores a 0,1 g/dL. Na eliminação
destes componentes, lavar com fortes
jactos de água a fim de prevenir a
acumulação de azidas de metal
potencialmente explosivas em
canalizações de cobre e chumbo.
Água: Usar água destilada ou
desionizada.
Radioactividade
A Siemens Healthcare Diagnostics tem de
receber uma cópia de qualquer certificado
de licença relativo a radioisótopos
(Específica ou Geral) emitida em nome de
cliente dos EUA antes de proceder ao
envio de kits ou componentes com
material radioactivo. Estes materiais
radioactivos podem ser adquiridos por
qualquer cliente com a licença Específica
adequada. Com uma licença Geral, estes
materiais radioactivos só podem ser
adquiridos por médicos, veterinários que
pratiquem medicina veterinária,
laboratórios clínicos e hospitais — e
unicamente para testes clínicos ou
laboratoriais in vitro que não envolvam a
administração externa ou interna do
material radioactivo ou a sua radiação em
seres humanos ou outros animais. A sua
aquisição, recepção, armazenagem,
utilização, transferência e eliminação
estão todas sujeitas aos regulamentos e a
uma licença (Geral ou Específica) da
Comissão Reguladora Nuclear dos EUA
ou de um Estado com o qual a NRC tenha
estabelecido um acordo de aplicação de
controlo legal.
Manusear materiais radioactivos em
conformidade com os requisitos da licença
Geral ou Específica. Para minimizar a
exposição à radiação, o utilizador deverá
cumprir as directivas definidas na
publicação do National Bureau of
Standards sobre o manuseamento seguro
de materiais radioactivos (Safe Handling
of Radioactive Materials – Manual N.º 92,
editado a 9 de Março de 1964) e em
publicações posteriores editadas pelas
autoridades estatais e federais norteamericanas.
Limpar imediatamente qualquer derrame e
descontaminar as superfícies afectadas.
Evitar a geração de aerossóis. Eliminar os
resíduos radioactivos sólidos de acordo
com os requisitos da licença. Os
detentores de licenças Gerais (detentores
do formulário 483 da NRC) podem
eliminar os resíduos radioactivos sólidos
como resíduos não radioactivos, após a
remoção dos rótulos. Os detentores de
licenças Específicas (Formulário 313 da
NRC) devem consultar o título 10 do
Código de Regulamentos Federais (Code
of Federal Regulations), Parte 20. Os
detentores de licenças de Estados com os
quais tenham sido estabelecidos acordos
deverão consultar os regulamentos
adequados do respectivo Estado. Os
detentores de licenças Gerais podem
eliminar os resíduos radioactivos líquidos
do tipo contido neste produto através de
um dreno de esgoto de laboratório. Os
detentores de licenças têm de remover ou
tornar ilegíveis os rótulos dos recipientes
vazios de materiais radioactivos antes de
os eliminar como resíduos sólidos. Os
detentores de licenças Específicas podem
eliminar pequenas quantidades de
resíduos radioactivos líquidos do tipo
utilizado neste produto através de um
dreno de esgoto de laboratório. Consultar
os regulamentos adequados e aplicáveis
ao respectivo laboratório.
Materiais Fornecidos:
Preparação Inicial
De notar que os materiais fornecidos com
este kit não são permutáveis com os do kit
Coat-A-Count Total T3.
Tubos Revestidos com Anticorpos de
T3 Livre (TF31)
Tubos de polipropileno revestidos com
anticorpos para tri-iodotironina (T3) e
embalados em saquetas de fecho
hermético. Armazenar refrigerado e
protegido da humidade, voltando a fechar
cuidadosamente as saquetas depois de
abertas: Estável a uma temperatura de 2–
8°C até ao prazo de validade indicado na
saqueta. Cor: azul marinho (aquamarine).
TKF31: 100 tubes.
125
T3 Livre I (TF32)
Marcador liofilizado, consistindo em
análogo de T3 iodado. Reconstituir cada
frasco, adicionando 110 mL medidos de
45
água destilada ou desionizada. Deixar
repousar durante 10 minutos e, em
seguida, misturar por inversão suave.
Estável a uma temperatura de
2–8°C durante 30 dias depois de
reconstituído, ou até ao prazo de validade
indicado no frasco.
TKF31: 1 frasco.
Calibradores de T3 Livre (F3C3–9)
Sete frascos, rotulados de A a G, de soro
humano processado liofilizado. Pelo
menos 30 minutos antes da utilização,
reconstituir o calibrador zero A com
2,0 mL de água destilada ou desionizada,
e cada um dos restantes calibradores de
B a G com 1,0 mL de água destilada ou
desionizada. Utilizar pipetas volumétricas
e misturar por agitação suave. Estável a
uma temperatura de 2–8°C durante 30
dias depois de reconstituído.
TKF31: 1 conjunto.
Os calibradores reconstituídos têm
valores de T3 livre específicos de lote de
aproximadamente 0, 0,5, 1,6, 3,5, 7,0, 21
e 42 picogramas de T3 livre por mililitro
(pg/mL); equivalente a: aproximadamente
0, 0,77, 2,5, 5,4, 11, 32 e 65 picomoles
por litro (pmol/L). Consultar os rótulos dos
frascos para valores exactos em pg/mL.
Para converter para pmol/L, multiplicar por
1,536.
Materiais Necessários Mas Não
Fornecidos
Contador gama — compatível com tubos
standard 12x75 mm
Misturador giratório
Preparação dos Reagentes
Proveta graduada: 110 mL
Pipetas volumétricas: 1,0 e 2,0 mL.
Água destilada ou desionizada
Radioimunoensaio
Tubos lisos de polipropileno 12x75mm —
para utilização como tubos NSB,
disponíveis na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: PPO)
Micropipetas: 100 µL e 1 000 µL
Banho-maria — capaz de manter a
temperatura de 37°C. Nunca é adequada
a utilização de um forno ou de uma placa
de aquecimento.
46
Dispositivo de decantação de espuma —
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: FDR).
Papel milimétrico logit-log
Controlos: Um controlo de três níveis de
imunoensaio baseado em soro humano,
contendo T3 livre como um dos mais de
25 constituintes submetidos a ensaio, está
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics. (número de catálogo: CON6).
Colheita
O paciente não necessita de estar em
jejum. Não são necessárias preparações
especiais. Colher sangue por punção
25
venosa para tubos lisos, e separar o
soro das células por centrifugação.
Foram registados efeitos tanto in vivo
como in vitro da heparina sobre as
8
hormonas tiroideias livres Assim, as
amostras não devem ser colhidas durante
ou após a administração deste
anticoagulante.
Amostras lipémicas, ictéricas ou
totalmente contaminadas podem causar
resultados errados. Recomenda-se o uso
de uma ultra centrífuga para clarear
amostras lipémicas.
Amostras hemolisadas podem indicar um
tratamento inadequado de um espécimen
antes da recepção em laboratório; assim,
os resultados devem ser sujeitos a uma
interpretação cautelosa.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count T3
Livre não foram ainda testados com todas
as possiveis variações originadas pelos
tipos de tubos. Consultar a secção Tipos
de Amostras Alternativas para obter
detalhes sobre os tubos que foram
testados.
Volume Necessário: 100 µL de soro por
tubo.
Estabilidade: 2 dias a 2–8ºC, ou 2 meses
congelado a –20°C.
Antes do ensaio, deixar as amostras à
temperatura ambiente (15–28°C) e
misturar através de movimentos suaves
ou por inversão. Aliquotar, se necessário,
a fim de evitar o descongelamento e
congelamento repetidos. Não tentar
descongelar espécimens congelados
aquecendo-os em banho-maria
diluição altera o equilíbrio entre a T3
livre e a T3 ligada, não é legítimo
esperar que o ensaio mantenha a
linearidade em diluição).
Procedimento de
Radioimunoensaio
Recomenda-se a utilização de uma
micropipeta de ponta descartável,
substituindo a ponta entre cada
amostragem, a fim de evitar
contaminação entre amostras.
Todos os componentes devem estar à
temperatura ambiente (15–28°C) antes da
sua utilização.
1
Tubos lisos: Rotular quatro tubos de
polipropileno lisos (não revestidos) de
12x75 mm com T (contagens totais) e
NSB (ligação não específica), em
duplicado.
3
Calibradores
Aproximado
pg/mL
0
0
B
0,5
0,77
C
1,6
2,5
D
3,5
5,4
E
7,0
11
F
21
32
G
42
65
Nota: Os valores dos calibradores são
valores específicos de lote. Consultar
o rótulo do frasco do calibrador para
valores em pg/mL. Para converter
para pmol/L, multiplicar por 1,536.
2
4
Pipetar 100 µL do calibrador zero A
para os tubos NSB e A, e 100 µL de
cada um dos restantes calibradores,
controlo e amostra de paciente para
os tubos preparados. Pipetar
directamente para a base do tubo.
Não tentar diluir as amostras de
paciente que se preveja que
contenham concentrações elevadas
com o calibrador zero. (Dado que a
Ia
Incubar durante 3 horas a 37°C.
Utilizar o procedimento de banhomaria; não é adequada a utilização de
um forno nem de uma placa de
aquecimento.
5
Aproximado
pmol/L
A (MB)
125
Os laboratórios equipados com um
pipetador-diluidor fiável podem
efectuar os passos 2 e 3 em
simultâneo, embora devam ter o
cuidado de evitar a contaminação
entre tubos. Não deverão passar mais
de 10 minutos durante a dispensação
do marcador. Reservar os tubos T
para contagem na etapa 6; não
necessitam de mais processamento.
Dado que a ligação não específica no
procedimento Coat-A-Count é
caracteristicamente baixa, os tubos
NSB podem ser omitidos com
segurança sem comprometer a
precisão ou o controlo de qualidade.
Tubos revestidos: Rotular catorze tubos
revestidos com anticorpos de T3 Livre
com A (ligação máxima) e com B a G, em
duplicado. Rotular tubos adicionais
revestidos com anticorpos, também em
duplicado, para controlos e amostras de
paciente.
Adicionar 1,0 mL de T3 Livre
cada tubo. Turbilhonar.
Decantar completamente.
Remover toda a humidade visível
melhora significativamente a precisão.
Usando um dispositivo de decantação
de espuma, decantar o conteúdo de
todos os tubos (à excepção dos tubos
T) e deixá-los escorrer durante 2 ou 3
minutos. De seguida, sacudir os tubos
vigorosamente contra papel
absorvente para eliminar todas as
gotas residuais.
6
Contar durante 1 minuto num
contador gama.
Cálculo dos Resultados
Para obter resultados em termos de
concentração a partir de uma
representação logit-log da curva de
calibração, começar por calcular a média
das contagens por minuto corrigidas com
NSB de cada par de tubos:
Contagens reais = (Média CPM) minutos (Média
NSB CPM)
De seguida, determinar a ligação de cada
par de tubos como uma percentagem de
ligação máxima (MB), considerando as
47
contagens corrigidas com NSB dos tubos
A como 100%:
Percentagem de Ligação = (Contagens reais /
Contagens MB reais) × 100
(O cálculo pode ser simplificado através
da omissão da correcção na ligação não
específica; as amostras dentro da gama
dos calibradores produzem normalmente
os mesmos resultados quando a
Percentagem de Ligação é calculada
directamente a partir da CPM Média).
Usando papel milimétrico logit-log,
representar a Percentagem de Ligação no
eixo vertical (probabilidade) relativa à
Concentração no eixo horizontal
(logarítmico) para cada um dos
calibradores diferentes de zero, e
desenhar uma linha recta aproximando a
trajectória destes pontos. Os resultados
das amostras desconhecidas podem ser
então lidos a partir da linha, por
interpolação.
Recomenda-se a análise dos resultados
para verificar a concordância entre as
réplicas, e para construir um gráfico da
curva de calibração (mesmo que os
cálculos sejam processados por
computador) como verificação visual da
adequação da transformação usada e
como forma de detectar pontos de
calibração divergentes. Recomendamos
também o acompanhamento destes
parâmetros de redução de dados.
T = Contagens Totais (como contagens por
minuto)
%NSB = 100 × (Média Contagens NSB /
Contagens Totais)
%MB = 100 × (Contagens reais / Contagens
Totais)
E os 20, 50 e 80 porcento "intercepa,"
onde
20% = Concentração a 20 por cento de Ligação,
etc.
De notar que outras abordagens, por ex.,
uma implementação correcta da logística
de 4 parâmetros, são também aceitáveis.
Ver Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985; 31:1264-71:
específicos de lote, as concentrações
listadas na coluna mais à direita podem
não coincidir com os valores dos
calibradores fornecidos na vossa
remessa. (Ver tabela “Exemplo de
Ensaio”.)
Controlo de Qualidade
Controlos (ou pools de soro) com pelo
menos dois níveis de concentração de T3
livre — baixo e elevado — devem ser
submetidos por rotina a ensaio como
amostras desconhecidas.
Transmitir os resultados de paciente
apenas se os resultados do controlo
satisfizerem os critérios definidos pelo
laboratório como critérios de
admissibilidade.
É boa prática laboratorial registar para
cada ensaio os números de lote dos
componentes usados, bem como as datas
em que foram reconstituídos ou abertos
pela primeira vez. Recomendamos
igualmente que sejam representados em
gráfico os resultados de dia para dia –
conforme descrito, por exemplo, em
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. De notar que as amostras de
repetição podem funcionar como uma
ferramenta adicional útil para monitorizar
a precisão inter-ensaio, e que os pares de
tubos de controlo podem ser espaçados
ao longo do ensaio a fim de ajudar a
verificar a ausência de desvio significativo.
Valores de Referência
Foram submetidas a ensaio amostras de
soro de 405 adultos com função tiroideia
normal (eurtiróides) com o procedimento
Coat-A-Count Free T3 (ver o gráfico no
final desta secção). Foram também
submetidas a ensaio amostras de 19
pacientes de hipertiróide e de 13
pacientes de hipotiróide, bem como
amostras de mulheres no primeiro e
terceiro trimestres de gravidez. A análise
dos resultados de T3 livre destas
amostras produziu as seguintes
estatísticas.
Exemplo de ensaio: Para ilustração
apenas, não serve para calcular os
resultados de outro ensaio. Uma vez que
os valores dos calibradores são valores
48
95% Centrais
n
pg/mL
pmol/L
405
1,4 – 4,4
2,2 – 6,8
Hipertiroidismo
19
5,2 – 22,6*
8,0 – 35*
Hipotiroidismo
13
0,3 – 3,1*
0,5 – 4,8*
1º Trimestre
17
2,1 – 4,7*
3,2 – 7,2*
3º Trimestre
20
1,7 – 4,6*
2,6 – 7,1*
n
pg/mL
pmol/L
405
2,8
4,3
Hipertiroidismo
19
9,2
14
Hipotiroidismo
13
0,6
0,9
1º Trimestre
17
3,0
4,6
3º Trimestre
20
3,1
4,8
Eutiroidismo
Gravidez
Intervalo Absoluto
Mediana
Eutiroidismo
Gravidez
Estes limites devem ser considerados
apenas como directrizes. Cada laboratório
deverá definir as suas próprias gamas de
referência.
A interpretação dos resultados de T3 livre
é complicada uma vez que há uma série
de fármacos que podem afectar a ligação
da T3 às proteínas transportadoras da
hormona tiroideia.
Em doenças graves não tiroideias, a
avaliação da função tiroideia torna-se
especialmente difícil. Uma vez que alguns
pacientes nesta categoria poderão sofrer
de hipotiroidismo primário concomitante
ou de um hipotiroidismo secundário
compensatório, o imunoensaio TSH é
recomendado como um teste de
confirmação neste contexto.
Em estados raros associados a variações
extremas na capacidade de ligação à
albumina – tal como a hipertiroxinemia
desalbumínica hereditária (FDH) – os
ensaios directos da hormona tiroideia livre
podem produzir resultados erróneos.
Os auto anticorpos da T3 em circulação, e
os inibidores de ligação da hormona,
2,3,11
podem interferir com o ensaio.
Dados de Desempenho
Ver Tabelas e Gráficos para dados
representativos do desempenho do kit
Coat-A-Count Free T3. Os resultados de
T3 livre nas secções abaixo são
expressos em pg/mL. A menos que
especificado em contrário, todos os
resultados foram gerados a partir de
amostras de soro.
Factores de Conversão:
pg/mL × 1,536 → pmol/L
Calibração: 0,5 – 42 pg/mL (0,77 –
65 pmol/L) Os valores dos calibradores
são valores específicos de lote.
Limitações
O ensaio de T3 livre funciona
primordialmente como um teste de
confirmação para o hipertiroidismo e é de
valor muito limitado num quadro de
hipotiroidismo. Conforme indicado na
tabela Valores Previstos, a grande maioria
dos pacientes com hipertiroidismo terão
valores de T3 livre acima do limite
superior para os valores normais; no
entanto, nem todos esses pacientes serão
identificáveis segundo este meio, uma vez
que poderá haver alguma sobreposição
entre as gamas de eutiróide e hipertiróide.
Sensibilidade Analítica: 0,2 pg/mL
(0,31 pmol/L),
Precisão Intra-ensaio (Entre Ensaios):
A precisão das amostras submetidas a
ensaio duplo está representada
graficamente no perfil de precisão, com
base em nove amostras e
aproximadamente vinte graus de
liberdade. (Ver gráfico "Perfil de
Precisão".)
Precisão Inter-Ensaio (Ensaio a
Ensaio): Foram calculadas estatísticas
para uma em cada três amostras a partir
dos resultados de pares de tubos em 20
ensaios diferentes. (Ver tabela “InterEnsaio”.)
49
Efeito Fim-de-Série: nenhum até
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela
“Efeito Fim-de-Série”.)
Especificidade: O antisoro é altamente
específico para tri-iodotironina. As
reactividades cruzadas relativas (peso por
peso com uma ligação de 50%) obtidas
com o kit Coat-A-Count Free T3 são
indicadas abaixo. (Ver tabela
“Especificidade”).
Bilirrubina: Níveis de 100 ou 200 mg/L
têm um efeito marginal sobre o ensaio.
(Ver tabela “Bilirrubina”.)
Hemólise: A presença de hemoglobina
em concentrações de até 30 mg/L não
tem qualquer efeito nos resultados, dentro
da precisão do ensaio.
Tipo de amostra alternativa: Para
determinar o efeito de amostras
alternatives, foi colhido sangue de 32
voluntários em tubos secos, com EDTA e
tubos de vacum heparinizados. Todas as
amostras foram ensaiadas pelo método
Coat-A-Count Free T3, com os seguintes
resultados.
Soro
Média pg/mL
3,4
Heparina
EDTA
2,9
2,7
Baseado em estudos é recomendado que
amostras sejam colectadas como soro.
Efeito da Albumina: Para que o
procedimento de T3 livre por método de
análogo possa ser realizado com êxito, é
essencial que o marcador análogo não se
ligue às proteínas transportadoras
endógenas, incluindo a TBG e a
albumina. Os métodos análogos para T3
livre anteriores eram significativamente
afectados pelas variações no nível de
24
albumina em circulação. A experiência
seguinte foi concebida para demonstrar
que as variações nos níveis de albumina
não têm qualquer efeito no procedimento
Coat-A-Count Free T3. Cinco amostras de
mulheres no terceiro trimestre da gravidez
foram cada uma delas divididas em quatro
alíquotas. Foi adicionada albumina de
soro humano absorvida em carvão
(CAHSA) em concentrações de 0, 10, 20
e 50 mg/mL, e as quatro alíquotas foram
de seguida submetidas a ensaio duplo
com o procedimento Coat-A-Count Free
T3. O valor médio de cada concentração
de albumina (n=5) foi então representado
50
relativamente à concentração aparente de
T3 livre. Torna-se evidente, a partir dos
valores, que os resultados não foram
alterados pela adição de albumina até
5,0 g/dL, para uma concentração de
albumina total de aproximadamente 8,0
g/dL. (Ver gráfico "Efeito da Albumina".)
Efeito dos Ácidos Gordos Não
Esterificados: A fim de determinar se os
ácidos gordos livres (não esterificados)
interferem com o procedimento
Coat-A-Count Free T3, foi adicionado
ácido oleico — um membro representativo
desta família — em várias concentrações
a cada uma das 4 amostras de paciente.
Todas as amostras foram de seguida
submetidas a ensaio com o procedimento
Coat-A-Count Free T3. Foi calculada a
média dos resultados das quatro
amostras. Foram encontrados níveis
aumentados de ácidos gordos livres numa
série de condições, incluindo gravidez
tardia e terapêutica com heparina. A
tabela mostra que o procedimento
Coat-A-Count Free T3 permanece
essencialmente inalterado mesmo em
presença de aumentos substanciais do
nível de ácidos gordos livres em
circulação. (Ver tabela “Efeito dos Ácidos
Gordos Não Esterificados”):
Efeito da Fenitoína: Amostras de
paciente foram adicionadas com até
50 µg/mL de fenitoína. (Tóxica: acima de
25 µg/mL.) As amostras foram submetidas
a ensaio, com e sem adição, com o
procedimento Coat-A-Count Free T3, e os
resultados foram apresentados numa
tabela. Os resultados mostram que a
níveis de 10 µg/mL e superiores, a
fenitoína tem um efeito clinicamente
significativo sobre o ensaio Coat-A-Count
Free T3. (Ver tabela "Efeito da
Fenitoína".)
Efeito da Fenilbutazona: Amostras de
1 000 µg/dL de fenilbutazona. (Tóxica:
acima de 20 µg/dL.) As amostras foram
submetidas a ensaio, com e sem adição,
com o procedimento Coat-A-Count Free
T3, e os resultados foram apresentados
numa tabela. Os resultados mostram que
a fenilbutazona não tem efeito in vitro no
procedimento Coat-A-Count Free T3. (Ver
tabela "Efeito da Fenilbutazona".)
Efeito do Salicilato: Amostras de
100 mg/dL de salicilato. (Tóxico: acima de
30 mg/dL.) As amostras foram submetidas
a ensaio, com e sem adição, com o
procedimento Coat-A-Count Free T3. Os
resultados mostram que o salicilato não
tem efeito in vitro no procedimento
Coat-A-Count Free T3. (Ver tabela "Efeito
do Salicilato".)
Efeito da TBG: A fim de determinar se a
globulina de ligação da hormona tiroideia
(TBG) se liga ao marcador análogo, a
seguinte experiência foi realizada usando
125
o marcador análogo I do kit
Coat-A-Count Free T3. Resina de TBG à
qual foi retirada toda a T3 aparente foi
adicionada ao calibrador zero em
concentrações de 0, 1, 2 e 5 g/dL. Todas
as amostras foram submetidas ao
procedimento Coat-A-Count Free T3.
Tendo capacidade de ligação à TBG,
menor quantidade do marcador análogo
ficará ligada ao anticorpo imobilizado. Os
valores de percentagem de ligação
observados (%B/B0) mostrados na tabela
indicam que o marcador não se liga à
TBG. (Ver tabela "Efeito da TBG".)
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symboles suivants peuvent apparaître sur les
étiquettes des produits : / Sull'etichetta del
prodotto possono essere presenti i seguenti
simboli: / Os seguintes símbolos podem
aparecer no rótulo dos produtos:
Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
PITKF3 – 8
51
Symbol Definition
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro
Biológico Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
52
Symbol Definition
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
LOT
Symbol Definition
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente
53

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