Versuch 7 - DNA Fingerprint

Versuch 7
„DNA - Fingerprint“
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Max Mustermann
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C. Weindel & M. Schwarz
Einleitung
Ziel des Versuches ist die Erlernung des Prinzips und der Methode der Isolierung von
DNA aus eukaroytischen Zellen und das Prinzip der PCR (Polymerase-chainreaction). Es soll auch das Prinzip des DNA-Fingerprintings (=Prinzip des
Vaterschaftstests) verstanden werden. Im Versuch hat jeder Praktikumsteilnehmer
seine eigene DNA aus Mundschleimhautzellen isoliert. Bei der anschließenden PCR
wird jeweils der gleiche Bereich des Genoms der Praktikumsteilnehmer amplifiziert.
Durch spezifische Primer wird gewährleistet, dass nur der gewünschte DNAAbschnitt amplifiziert wird. Im Versuch war dieser Bereich das Pseudogen 2 des
beta-Actin. Dieser DNA -Abschnitt ist ein sogenannter Fingerprintbereich.
Beim DNA-Fingerprinting werden Bereiche aus dem Genom, die bei jedem
Menschen in etwas verschiedener Form vorkommen, durch PCR amplifiziert (durch
spezifische Primer). Typische Fingerprintbereiche sind Bereiche im Genom mit
repetetiven Sequenzen (repeats). Die Anzahl der Wiederholungen dieser repeats
innerhalb des Bereichs und somit die Länge des Fingerprintbereichs ist meist von
Mensch zu Mensch verschieden. Trägt man nun die durch PCR in diesem
Fingerprintbereich amplifizierte DNA auf ein Agarosegel auf erscheinen
typischerweise zwei Banden auf dem Gel, da der Bereich sich auf zwei Allelen
befindet, die selten übereinstimmen. Ein Allel stammt vom Vater eins von der
biologischen Mutter. Die Tatsache, dass die Allele so verschieden sind
(unterschiedliche Anzahl von repeats) und selten homozygot vorkommen, macht sie
brauchbar für das DNA-Fingerprinting (Prinzip des Vaterschaftstests).
Oft werden Pseudogene als Fingerprintbereich genommen, da sie die gewünschten
Eigenschaften, nämlich die Heterozygotie, das Vorkommen von repetiven
Sequenzen und Variabilität der Anzahl dieser, aufweisen. Pseudogene sind
Bestandteile des Genoms, die inaktiv, aber stabil sind. Sie sind durch Mutation aus
aktiven Vorläufergenen hervorgegangen.
Beim international anerkannten Vaterschaftstest werden 17 Fingerprintbereiche auf
deren Übereinstimmung bei Vater, Mutter und Kind untersucht. Industriell wird der
Vaterschaftstest mit Hilfe der Kapillarelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten
Primern durchgeführt. Erreicht nun nach einer bestimmten Zeit eine Allelfraktion den
Fluoreszenzdetektor sendet dieser ein Signal welches aufgezeichnet wird. Bei der
Auswertung der Ergebnisse einer solchen Kapillarelektrophorese vergleicht man die
zeitliche Abfolge des Auftretens von peaks im Gegensatz zum Vergleich von Banden
bei der Gelelektrophorese. Da die Auflösung der peaks im Vergleich zur Auflösung
der Banden eines Gels viel höher ist, ergibt die Kapillarelektrophorese erheblich
genauere Ergebnisse.
Material und Methode
Der Versuch wurde exakt nach Versuchsanleitung durchgeführt.
Ergebnisse
Auswertung
Ich hatte meine Probe in Spur 3 des Gels aufgetragen. Da mir wahrscheinlich bei der
DNA Aufreinigung ein Fehler unterlaufen ist, sieht man nicht Mal Banden (Schmier)
von genomischer DNA. In meiner Spur ist am unteren Ende ganz leicht etwas zu
erkennen, was aber für die Diskussion der Methode nicht ausreicht. Deshalb habe
ich Spur 1 und 2 (Anika) gewählt um anhand dieser die Ergebnisse zu erläutern.
Am Anfang der beiden Spuren treten verwischte Banden (Schmier) auf. Hierbei
handelt es sich um genomische DNA. Da man die verwischten Bereiche gut
erkennen kann, muss hier eine relativ große Menge an DNA vorliegen um diese
intensive Färbung zu ermöglichen. Dies ist zu dadurch zu erklären, dass beim
Abstrich ein sehr große Zahl von Zellen aufgenommen wird und deren gesamte
Genome mit auf das Gel aufgetragen wurden.
Bei Spur 2 folgen auf die verwischten Bereiche drei gut erkennbare Banden, die von
fremder DNA aus Nahrungsresten stammen.
Bei Spur 1 sind am untersten Ende drei Banden zu erkennen, bei Spur 2 liegen diese
näher beieinander und sind somit nicht so gut zu erkennen. Die untersten zwei
Banden bei Spur 1 stammen von den amplifizierten DNA-Bereichen, also dem
gewünschten PCR-Produkt.
Allerdings tritt bei einigen der Proben eine dritte Bande auf, selbst wenn der
Mundschleimhautabstrich sauber durchgeführt wurde. Die für die PCR verwendeten
Primer sind (auch laut BLAST) für das Pseudogen 2 von beta-Actin spezifisch. Es
dürften somit höchstens zwei Banden (eine von jedem Allel) auftreten, und keine
dritte Bande. Tritt nur eine Bande auf, ist der Längenunterschied der Allele so gering
und liegt unter dem Auflösungsvermögen der verwendeten Gelelektrophoresegeräte.
Die Wahrscheinlichkeit der Homozygotie für das untersuchte Merkmal (Pseudogen 2
von beta-Actin) ist sehr gering.
Bei Vergleich von Spur 1 mit Spur 2 sieht man, dass unterschiedliche Personen
meistens auch andere Längen des Pseudogens aufweisen. Die ungefähre Länge des
untersuchten Genomabschnitts liegt laut dem aufgetragenen Standard zwischen 200
und 300 Basenpaare.
Fazit
Die Methode des DNA-Fingerprintings ist unter Praktikumsbedingungen sehr
störanfällig z.B. durch Essensreste im Mund. Arbeitet man jedoch professionell und
mit modernen Geräten ist der genetische Fingerabdruck eine sehr genaue und sehr
gut reproduzierbare Methode zur Bestimmung von z.B. der Vaterschaft.
Literatur
-Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität-Mainz
-Biochemie, Stryer, Verlag: Spektrum, 1994 (2. durchgesehene Auflage)