Die 3 Phasen der PCR

Life Science Konferenz 05. Mai 2010 in Jena
Chancen und Möglichkeiten Real-time PCR
Die 3 Phasen der PCR
1. Denaturierung
 DNA-Doppelstrang wird in Einzelstränge aufgeschmolzen
 Für 30 sec auf 95°C erhitzen
 Genomische oder komplexe DNA wird vorab für 5-10 min denaturiert
Denaturierung
Die 3 Phasen der PCR
2. Annealing
 Anlagerung der Primer an die Template DNA
 für 15-30 sec auf 50-60°C abkühlen
 Annealing Temperatur (TA) kann anhand der Primer-Schmelztemperatur (TM)
abgeschätzt werden
Annealing
Die 3 Phasen der PCR
3. Extension
 Polymerase-vermittelte DNA-Synthese ausgehend vom Primer 3‘-Ende
(5‘→3‘-Synthese)
Extension
PCR-Reaktion
Zyklus 1
Denaturierung
Annealing
Zyklus 2
Zyklus 3
Zyklus 4
Zyklus n
16 Kopien
2n Kopien
Extension
2 Kopien
4 Kopien
8 Kopien
⇒ Die Menge an Produkt verdoppelt sich mit jedem Zyklus
N = Zahl der amplifizierten Moleküle
N = N0 * 2n
N0 = Zahl der Startmoleküle
n
= Zahl der Zyklen
Kinetik der PCR-Reaktion
Idealer Verlauf
Verlauf mit Sättigung
Idealfall
Sättigung
14,00
12,00
10,00
Log Kopienzahl
Log Kopienzahl
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
8,00
6,00
4,00
2,00
2,00
0,00
0,00
1
5
9 13 17 21 25 29 33 37
Zyklus
1
5
9 13 17 21 25 29 33 37
Zyklus
⇒ PCR Reaktionen verlaufen nie optimal, es kommt zu Sättigungseffekten
Gründe für den Sättigungseffekt:
 Produkte reannealen (Kompetition mit Primern)
 Anhäufung von inhibierenden Nebenprodukten
 Polymerase, Primer und dNTPs werden limitierend
Kinetik der PCR-Reaktion
Log (Kopienzahl)
Plateau Phase
Log Phase
Frühe Phase
Realer Verlauf einer
Produktassimilationskurve
einer PCR-Reaktion
Zyklus
 Frühe Phase
- Signal unterhalb des Detektionslimits
- Keine optimale Amplifikation, Reaktion muss sich erst „einschwingen“
 Log Phase
- Amplifikation läuft optimal (exponentielle Vervielfältigung)
 Plateau Phase
- Amplifikation läuft suboptimal wegen limitierender Reagenzien und
inhibierender Reaktionsprodukte
Das Problem der Quantifizierung
a
b
c
d
1
2
3
Log (Kopienzahl)
a
b
c
d
Zyklus
Auftrennung im Agarosegel
Endpunktanalyse im Agarosegel
 Schwierig, da nur in einem engen Zyklusfenster möglich
 nicht quantitativ
⇒ Quantifizierung nur über real-time PCR möglich
Quantitative Real-Time PCR
Die Zunahme der Fluoreszenzemission wird während der Reaktion überwacht und
als Indikator für Produktakkumulation verwendet. In jedem PCR-Zyklus (in
Echtzeit).

Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren
(Prinzip der PCR)

Zusätzlich Möglichkeit der Quantifizierung
über Fluoreszenz

Erzeugung fluoreszierender PCR-Produkte

Zunehmende Menge an PCR-Produkten →
steigende Fluoreszenz
Möglichkeiten:

Interkalierende Farbstoffe

Sequenzspezifische Sonden
Interkalierende Farbstoffe

SYBR Green

Fluoreszenz nach Einlagern in doppelsträngige
DNA:
 Zunahme Target-DNA korreliert mit
Zunahme der Fluoreszenz
 Keine Sequenzspezifität

Zwischen verschieden PCR Produkten kann nicht
unterschieden werden

Keine Multiplex-Messungen möglich

Schmelzkurvenanalyse nötig
Schmelzkurvenanalyse
 Fragmentlängen und somit Spezifität
bestimmbar
 Temperatur langsam kontinuierlich
erhöht: Aufschmelzen der DNA
 Bei fragment-spezifischer
Schmelztemperatur denaturiert
Doppelstrang in Einzelstrang
 SYBR Green wird freigesetzt →
Fluoreszenzabnahme
 Unterscheidung da PCR-Produkt DNA
hat höheren Schmelzpunkt als
unspezifisch entstehende Primerdimer
Sequenzspezifische Sonden
Sonde: (z.B. Taqman)

Sequenzspezifisch

Fluoreszenz-Farbstoff (Reporter):
 FAM, VIC, ROX usw.

Quencher: „dämpft“ Reporter-Fluoreszenz
 TAMRA, Black-Hole-Quencher (BHQ)
Polymerase:

5‘-3‘-Exonuclease-Aktivität

Abbau Sonde bei Synthese des Stranges vom
5‘-Ende ausgehend

Quencher und Reporter entfernen sich räumlich
→ Fluoreszenz steigt an

Messung am Ende der Elongation jedes Zyklus
Einsatzgebiete der Detektionsmethoden
SYBR Green
Genspezifische Sonden
 Assays die nicht der Spezifität von
Sonden-basierten Assays bedürfen
 Allelische Diskrimierung
 Singleplex Reaktionen
 Generelles Screenen von Transkripten
 Wenn das PCR System voll optimiert ist
(keine Primer-Dimere, keine
unspezifischen Amplicons)
 Multiplex Reaktionen
 Amplifikation gering exprimierter
Transkripte
 Detektion seltener Pathogene
 Methylierungsspezifische PCR
qTOWER und TOptical
qTOWER
TOptical
Patentiertes Optisches System
Multiplexer
8 Optische
Fasern
LED
blau
LED rot
Motor 1
LED weiss
Lichtquelle
Farbmodul
8 Optische
Fasern
8 Kollimatoren
Rotierender
Modulträger
CPM Detektor
Konkaver
Spiegel
Messkopf
Motor 2
Spindel

Modulträger rotiert: 6 Umdrehungen/sek.

Shuttle mit 8 optischen Fasern liest 96
Wells spaltenweise aus

Dauer des Scanvorgangs ist unabhängig
von der Zahl der gemessenen Farben

Patent Nr. DE 2006 036 171 B4
Linsenarray
PCR Block
Aufbau des Multiplexers
Scanner
Filterrad
LED Lichtquelle
Photomultiplier
Funktionsweise des Multiplexers
6 Umdrehungen/sek
Farbmodul
grün
8 Kollimatoren
Farbmodul
gelb
LED Fluoreszenzlicht
zur Anregung
Farbmodul
rot
Farbmodul
blau
Enden der 8 optischen Fasern
Optischer Weg
Emissionsfilter (Interferenz)
Emissionsfilter (Glas)
Detektor
Strahlteiler
Lichtquelle
Anregungsfilter
Linse
Kollimatorlinse
Ferrule mit optischer Faser
Probe
Filter
 Anregung durch drei langlebige, hoch-intensive LEDs (blau, weiss, rot)
 Farbmodule mit Anregungs- und Emissionsfiltern
 Aufrüstung mit bis zu 4 (qTOWER) bzw. 6 (TOptical) Farbmodulen nach Wahl
 Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig
Filter
Anregung
Emission
Bsp. Farbstoffe
TOptical Filter Modul 1
470nm
520nm
FAM, SYBR Green, Alexa488
TOptical Filter Modul 2
515nm
545nm
JOE, VIC, HEX, Yakima Yellow
TOptical Filter Modul 3
535nm
580nm
TAMRA, DFO, Alexa 546, NED
TOptical Filter Modul 4
565nm
605nm
ROX, TexasRed, Cy3.5
TOptical Filter Modul 5
630nm
670nm
Cy5, Alexa 633, Quasar 670
TOptical Filter Modul 6
660nm
705nm
LightCycler Red 705, Alexa 680
TOptical FRET Modul 1
470nm
580nm
FAM/TAMRA
TOptical FRET Modul 2
470nm
670nm
FAM/Cy5
TOptical FRET Modul 3
470nm
705nm
FAM/Cy5.5
TOptical FRET Modul 4
515nm
670nm
JOE/Cy5
Fluoreszenzanregung
LED Anregung qTOWER / TOptical vs. Absorption Farbstoffe
100
LED Emission/Absorption
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
400
450
500
550
600
650
700
nm
FAM
JOE/HEX/VIC
6-ROX
TET
TAMRA
Cy5
Cy5.5
LED blau
LED weiss
 Drei LEDs zur bestmöglichen Anregung üblich verwendeter Fluoreszenzfarbstoffe
LED rot
Block
qTOWER
 96 well low profile rapid (LPR)
Silberblock
 Heizrate 12°C/sek, Kühlrate 8°C/sek
TOptical
 96 well Silberblock
 Heizrate 6°C/sek, Kühlrate 4,5°C/sek
 Geeignet für kleinste Probenvolumina
 Geeignet für Standard PCR Tubes, 8er
Streifen, Mikrotiterplatten
 Korrosionsschutz durch GoldAnodisierung
 Korrosionsschutz durch GoldAnodisierung
 Sample Protection System (SPS)
 Temperaturgradient (optional)
Software
 Einfaches und übersichtliches Erstellen von Experimenten
 Inkl. Auswertungsmodulen für:
a) Absolute Quantifizierung
b) Relative Quantifizierung
c) ∆∆Ct-Quantifizierung
d) Allelische Diskrimierung
e) Schmelzkurvenanalytik
 MIQE-konforme Probendokumentation
 Benutzerverwaltung inkl. Adminstratorfunktion
 Zahlreiche Exporttools (Excel, REST, qBASE, Biogazelle)
Zusammenfassung
 Patentiertes optisches Shuttlesystem mit Hochleistungs-Optikfasern
 Optimale Anregung durch 3 verschiedenfarbige, langlebige LEDs
 Anregung und Detektion aller gewöhnlich verwendeten
Fluoreszenzfarbstoffe
 Einzigartige Flexibität durch kundenspezifische Konfektionierung mit
Farbmodulen
 Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig
qTOWER
TOptical
 rapidPCR - real time
 modulares Blocksystem
 Kleinste Probenvolumina
 Gradientenfunktion (optional)
 Multiplexing bis zu 4 Farben
 Multiplexing bis zu 6 Farben
 Geringe Leistungsaufnahme
 Offene Plattform für Kits und
Plastikmaterialien aller Art
 Geringer Platzdebarf
Trends in der real-time PCR
 Multiplex real-time PCR
 Kleine Reaktionsvolumina
 Rapid/Fast real-time PCR
 Offene Plattformen für alle Kits und Plastikwaren
 Flexibilität in der Konfiguration der Geräte
 Barcode-Reading
 LIMS-basierte Probendokumentation
 MIQE-konforme Erfassung von Versuchsabläufen
Real time PCR
Hauptanwendungsgebiete








Quantifizierung der Genexpression
Qualitätskontrolle und Assayvalidierung
Detektion und Quantifizierung von Pathogenen
Messung von DNA-Schäden (z.B. Microsatelliten-Instabilitität, Strahlenschäden)
Bestimmungen mitochondrialer DNA
Genotyptisierungen über allelische Diskriminierung
Bestimmung von Copy Number Variations (CNV)
Pharmakogenetik
Beispiele für neuere Techniken
 DNA-Methylierungsstudien
 miRNA Messungen
 Assymetrische lineare Amplifikation zur Bestimmung von low-level Transkripten
(LATE-PCR)
Neue real-time PCR Techniken
DNA-Methylierungsstudien
 Eukaryoten: - Regulation der Genexpression
 Prokaryoten: - Schutz vor Fremd-DNA
- Fehlerkorrektur bei der DNA-Neusynthese
Methode
 Nachweis der Methylierungsstellen nach Bisulfidkonversion der DNA
 Verwendung von spezifischen Sonden, die an unkonvertierte oder konvertierte
DNA-Abschnitte binden
MSP (methylation-specific real-time PCR)
Methylierte DNA
Nicht-methylierte DNA
CH3 CH3 CH3
CGCGTCG
ATC
CGCGTCG
ATC
Bisulfidkonvertierung
NaHSO3
CH3 CH3 CH3
UGUGTUG
ATU
CGCGTCG
Sonde 1
Sonde 2
UGUGTUG
ATU
CH3 CH3 CH3
CGCGTCG
Sonde 1 ACACAAC
Sonde 2 GCGCAGC
Sonde 2 GCGCAGC
Sonde 1
Nur Sonde 1
bindet
ATU
ATU
ACACAAC
Nur Sonde 2
bindet
Real-time PCR
Neue real-time PCR Techniken
LATE-PCR
 LATE-PCR wurde spezielle für die Amplifikation von low-copy Targets
entwickelt (Gewinn von 1-2 Ct-Werten)
 Kombination aus exponentieller Amplikation und linearer Amplifikation
 Verwendung von zwei Primern, wobei Primer 1 im deutlichen Überschuss
zu Primer 2 eingesetzt wird
 Während der ersten Zyklen exponentielle Vermehrung des Produkts
 Nach Aufbrauchen von Primer 2 nur noch lineare Amplifikation
 Originalpublikation: Sanchez et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA,
101(7):1933-1938.
LATE-PCR
(Linear After The Exponential PCR)
konventionelle real-time PCR
Exponentielle Amplifikation für ca. 40 Zyklen
Denaturierung
Frühe Phase
der
Amplifikation
Exponentielle
symmetrische
Amplifikation
Exponentielle
symmetrische
Amplifikation
Lineare
assymetrische
Amplifikation
Amplifikation
in Sättigung
Extension
Sondenbindung
bei hohen
Temperaturen
Annealing
LATE-PCR
Exponentielle
Amplifikation für
ca. 20 Zyklen
Lineare Amplifikation für ca. 50 Zyklen
Sondenbindung
auch bei
niedrigen Temp
an Einzelstränge
erleichtert
Lineare
assymetrische
Amplifikation
Neue real-time PCR Techniken
miRNA Profiling
 miRNAs spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression
bei Eukaryoten (Abbau von mRNA - Organogenese, Tumore)
 miRNAs sind kleine, non-coding RNAs, die durch die RNA-Polymerase II
synthetisiert werden
 Sie unterliegen einer Reifung: pri-miRNA -> pre-miRNA -> miRNA
 miRNAs haben keinen PolyA-Tail
RISC
RISC
5‘
3‘
pri-miRNA
5‘
3‘
5‘
3‘
3‘
5‘
pre-miRNA
Dicer
Drosha
Zellkern
Cytosol
5‘
3‘
5‘
mRNA
AAAA 3‘
Neue real-time PCR Techniken
miRNA Profiling
Stem-Loop basierte cDNA-Synthese
und sondenbasierter Nachweis
Bindung eines loopRT Primers
Oligo(dT) basierte cDNA-Synthese
und SYBR Green Nachweis
miRNA
miRNA
5‘
5‘
3‘
Stem-Loop
RT-Primer
cDNA
Erststrangsynthese
3‘
(A)n
Polyadenylierung
(A)n
(T)n
cDNAErststrangsynthese
Oligo(dT)Primer mit Tag
Zweitstrangsynthese
miRNA
spezifischer
Primer
miRNA
spezifischer
Primer
Amplifikation
(T)n
Zweitstrangsynthese
(A)n
Amplifikation
(T)n
miRNA
spezifische
Sonde
Detektion über
SYBR Green
Neue real-time PCR Techniken
High resolution melting - HRM
 Hochauflösende Schmelzkurve mit kleinen Temperaturinkrementen
 Verwendung von quantitativ interkalierenden 3rd Generation Farbstoffen
wie SYTO9, LCGreen oder Eva Green™
 Hohe Temperaturuniformität des Thermocycler-Blocks erforderlich
Fluoreszenz
 Detektion von einzelnen Nukleotidaustauschen
Mutierte DNA
Normale DNA
agtactggactaggttactcttagccta
55°C
agtactggactaggctactcttagccta
Temperatur
95°C
HRM™ und LCGreen sind Warenzeichen von Idaho Technologies, SYTO®9 Invitrogen Corporation, Eva Green™ Biotium Inc
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !
Wir wünschen Ihnen allen
einen interessanten und
abwechslungsreichen
Tag !
Technische Spezifikationen
TOptical
qTOWER
Blockformat
96 well standard, Silber
96 well rapid, Silber
Blockwechsel
Ja
Nein
Gradient
Optional
Nein
Max. Heizrate
6,0°C/sek
12,0°C/sek
Max Kühlrate
4,5°C/sek
8,0°C/sek
Blockhomogenität
+/- 0,15°C bei 55°C
+/- 0,2°C
+/- 0,25°C bei 72°C
+/- 0,50°C bei 95°C
Kontrollgenauigkeit
+/- 0,1°C
+/-0,2°C
Probenvolumen
5µl bis 80µl
5µl bis 20µl
LED
blau, warmweiss, rot
blau, warmweiss, rot
Anregung
8 Hochleistungs-Optikfasern
in Shuttle
8 Hochleistungs-Optikfasern
in Shuttle
Max. Filteranzahl
6
4
Scandauer 96 well
6 sek
4 sek
Software
qPCRSoft
qPCRSoft
Algorithmen
Absolute Quantifizierung
Absolute Quantifizierung
Relative Quantifizierung
Relative Quantifizierung
∆∆Ct-Quantifizierung
∆∆Ct-Quantifizierung
Allelische Diskrimierung
Allelische Diskrimierung
Schmelzkurvenanalytik
Schmelzkurvenanalytik