Eletroforese Capilar

1
Métodos de Separação
- Análise QUALI e QUANTITATIVA de substâncias.
Métodos Cromatográficos
-Cromatografia em papel
-Cromatografia em camada delgada
-Cromatografia em fase gasosa
-Cromatografia em fase líquida
Métodos Eletroforéticos
-Eletroforese Capilar
-Eletroforese em Microchips
-Eletroforese em gel
-Eletroforese bi-dimensional
Métodos
Eletroforéticos de
Análise
Mecanismos de Separação: Eletroforese Capilar em Solução Livre
2
Eletroforese Capilar - Definições
3
“Técnica de separação baseada nas diferentes velocidades de
migração apresentadas pelos analitos, quando submetidos à ação
de um elevado campo elétrico.”
Técnicas de Eletromigração em Capilares:
Família de técnicas que empregam campo elétrico na separação
e/ou na movimentação dos analitos em sistemas capilares.
“Terminology and Nomenclature in Capillary Electroseparation Systems”
Knox, H. J.; J. Chromatogr. A 1994, 680, 3-13.
“Terminology for Analytical Capillary Electromigration Techniques”
Riekkola, M. L.; Jönsson, J. A.; Smith, R. M.; Pure Appl. Chem. 2004, 76(2),
443-451.
1
4
 Eletroforese em Capilares
 Eletroforese em Microchips
 Eletroforese em Gel
 Focalização Isoelétrica
 Eletroforese Bidimensional
 Aplicações
5
Objetivos
- Compreender o funcionamento do mecanismo
relacionado à separação eletroforética em solução livre.
de
separação
- Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do
potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação.
- Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e
mobilidade eletrosmótica.
- Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida.
- Familiarizar com a instrumentação básica.
6
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Amostra
Tampão
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
2
7
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Perfil Parabólico
(pressão)
EOF
8
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Estrutura da sílica fundida
O
Si
O
Si
O
Si
OH
Si
O
Si
O
Silanol isolado
O
H
O
Si
O
Si
Silanóis vicinais
H
O
O-
Silanol dissociado
Si
O
O
Si
Si
O
O Siloxano
O
Si
O
Si
O
Si
O
OH
Silanóis geminais
Si
OH
9
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
CAPILAR
O
IHP
OHP
O
O
H + H
+
O
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
H
+
+
+
PC (z )
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
3
10
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fatores que afetam o EOF
 pH (z) 
 Potencial Aplicado (E) 
 Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z)
 Temperatura (h) 
 Solventes Orgânicos (h, e, z)
 Modificação da Superfície do capilar
 Aplicação de um potencial radial externo
11
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
Fatores que afetam o EOF
mEOF / 10-4 cm2 V-1 s-1
pH
Fluxo Eletrosmótico (EOF)
mEOF / 10-8 m2 V-1 s-1
Fatores que afetam o EOF
12
Concentração
2.0
1.5
1.0
0.5
4
13
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Tampão
Amostra
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
14
Mobilidade Eletroforética
Detector
n
capilar
plug
l
(comprimento até o detector)
L
(comprimento total)
v
s
t
v
l
tm
15
Mobilidade Eletroforética
v
l
tm
v  me E  me
(1)
V
L
(2)
Combinando-se (1) e (2), temos:
l
V
 me
tm
L
me 
lL
t mV
tm 
lL
meV
5
16
Eletroforese Capilar
Sinal do Detector (U.R.)
1,3
1,2
1,1
1,0
0
2
4
6
8
Tempo (min)
17
Efeito do Potencial Aplicado
2,0
+
K
Ca
2+
Na
+
Mg
2+
+
Li
5,0 kV
Sinal (U.R)
1,5
7,5 kV
1,0
10 kV
0,5
20 kV
0,0
25 kV
-0,5
0
2
4
6
8
10
Tempo (min)
18
Tempo de Migração
tempo de migração (min)
20
15
10
5
0
0
5
10
15
Potencial (kV)
6
Quanto maior o potencial, mais rápida a análise?
19
5
Corrente (mA)
4
U=Rxi
y = ax + b
3
a = 1/R
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
Potencial (kV)
Controle de Temperatura
20
• Efeito Joule
21
Polaridade Normal
CAPILAR
O
O
O
H + H
+
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
7
22
Eletroforese Capilar
Detector
Capilar
Controle
Tampão
Tampão
Amostra
Fonte de
Alta Tensão
LT = 30 - 50 cm
23
Polaridade Normal
CAPILAR
O
O
O
H + H
+
O
H
O
H
-
H
+
+
+
+
O
+
H
+
+
+
O
H
-
+
+
+
-
+
+
+
+
24
Eletroforese Capilar
- Técnica de separação baseada na diferença
de mobilidade (velocidade) de compostos
iônicos ou ionizáveis sob ação de um campo
elétrico.
vep
E
 mep 
ze
6hr
8
25
Mobilidade Aparente
meof
ma  mef  meof
ma
mef
ma > 0
meof
ma = 0
mef
meof
ma
ma < 0
mef
26
Análise de Cátions
ma  mef  meof
Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente
de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm2 V-1 s-1.
Considerando o valor de meof = 1,010-4 cm2 V-1 s-1,
calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie
analisada.
27
Análise de Ânions
ma  mef  meof
ma < 0
???
9
28
Análise de Ânions
0,6
meof  3Poliéster-toner
,0 x105
0,4
mep  1,0 x104
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
Fluxo Invertido
mapp = mep + meof
0,2
FL
CM
map  ???
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
50
100
150
200
29
Análise de Ânions
Fluorescência (URF)
0,4
Poliéster-toner
Fluxo Normal
0,3
0,6
Fluxo Invertido
0,4
mapp = mep + meof
0,2
Poliéster-toner
FL
CM
0,2
0,1
0,0
0,0
0
50
100
Tempo (s)
150
0
200
50
100
150
30
Eficiência da Separação
t 
N  16 m 
 wb 
2
2,0
Fluorescência (URF)
0,3
Fluorescência (URF)
200
Toner preto
(Imp. Monoc.)
0,2
0,1
0,0
0
30
60
90
120
Tempo (s)
150
180
Toner preto
(Imp. Colorida)
1,5
1,0
0,5
0,0
0
30
60
90
120
150
180
Tempo (s)
10
31
Resolução
t t 
R  2 m 2 m1 
 w1  w2 


1
m
N _ 


4
 m 
R
tm2




1
V


R
 m  _


4 2
D
m

m
 
EOF  

 
tm1
wb1
wb2
1/2
32
0,35
28,3608
Exemplo 1
0,25
41,9472
Resposta (UR)
0,30
0,20
0,15
0,10
0,05
wb2 = 9,50
wb1 = 7,35
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (s)
33
0,35
8,4888
Exemplo 2
0,25
12,5496
Resposta (UR)
0,30
0,20
0,15
0,10
0,05
wb2 = 4,80
wb1 = 3,56
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Tempo (s)
11
34
0,30
18,9
Exemplo 03
27,972
Resposta (UR)
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
wb1 = 5,11
w b2 = 7,07
0,00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
35
Seletividade (a)
Outros fatores que
afetam a seletividade:
-EOF
-Temperatura
-Composição do tampão
-Adsorção à parede do capilar
Tampão: Borato 100 mM; Capilar 25 mm, 17 cm até o detector; Potencial 30 kV;
Detecção UV em 200 nm.
Instrumentação Básica
36
Fonte de
Alta Tensão
D
Pt
Reservatórios
12
Instrumentação Básica
37
Capilares
Fonte de Alta Tensão
• Potencial: 0-30 kV
• Corrente: 400 mA
• Potência: 12 W
360 mm
• Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK
• Comprimento: 20 a 70 cm
• Diâmetro Interno: 20 a 75 mm
75 mm
Controle de Temperatura
Injeção de Amostra
Detecção
Coleta de Frações
Injeção da Amostra
38
A introdução da amostra no capilar pode ser feita de
duas maneiras:
Aplicando-se pressão ao capilar
 Injeção Hidrodinâmica
Pressão positiva ou negativa
Gravidade
Utilizando-se campo elétrico
 Injeção Eletrocinética
Injeção da Amostra
39
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão)
P
Pr 4t
V
8hL
P
V : Volume Injetado
P : Gradiente de Pressão
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
h : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
13
Injeção da Amostra
40
Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade)
V
h
rghr 4t
8hL
V : Volume Injetado
r : Densidade
g : Aceleração da Gravidade
h : Diferença entre os níveis
r : Raio do capilar
t : Tempo de Injeção
h : Viscosidade
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
41
Injeção Eletrocinética da Amostra
Fonte AT
Q
Vctr 2 mep  meo 
L
Q : Quantidade de Material Injetado
c : Concentração
r : Raio do Capilar
t : Tempo de Injeção
mep : Mobilidade Eletroforética
meo : Mobilidade do FEO
L : Comprimento do Capilar
Injeção da Amostra
42
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t0 = 0
E
K+
Na+
H20
14
Injeção da Amostra
43
Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)
t1 > 0
E
K+
Na+
H20
Introdução
44
Detecção Direta ou Indireta ??
Métodos Ópticos
45
15
46
Absorção UV-vis
b
Io
T
I
I
I0
A   log T  ebc
Absorção UV-vis
47
Absorção UV-vis
48
Detecção UV-vis mono-canal
16
49
Absorção UV-vis
Detecção UV-vis mono
canal - Exemplos
Absorção UV-vis
50
Detecção UV-vis multi-canal
Absorção UV-vis
51
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
17
52
Absorção UV-vis
Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos
Eletroforese em Microchips
53
LT = 3 - 5 cm
54
Eletroforese em Microssistemas
18
55
56
57
Exemplos
19