Universidade Federal do Pará - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq, CNPq/AF, UFPA,
UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Agosto/2014 a Julho/2015
( ) PARCIAL
(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Engenharia biológica de microalgas e cianobactérias: da prospecção de linhagens à
produção de bioenergia
Nome do Orientador: Evonnildo Costa Gonçalves
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Biotecnologia
Instituto/Núcleo: ICB/Genética
Laboratório: Laboratório de Tecnologia Biomolecular
Título do Plano de Trabalho: Análise genética do potencial de cianobactérias amazônicas para a produção de
bioenergia
Nome do Bolsista: Aline Madeira Marques
Tipo de Bolsa:
(X) PIBIC/ CNPq
( ) PIBIC/CNPq – AF
( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador
( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/UFPA – AF
( ) PIBIC/ INTERIOR
( )PIBIC/PARD
( ) PIBIC/PADRC
( ) PIBIC/FAPESPA
( ) PIBIC/ PIAD
( ) PIBIC/PIBIT
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INTRODUÇÃO
As cianobactérias há muito são conhecidas devido aos problemas causados em florações,
as quais levam a impactos ecológicos e econômicos. Tais florações são comuns tanto em
corpos de águas dulcícolas, especialmente na existência de condições eutróficas, quanto em
oceanos oligotróficos (Cohen & Gurevitz, 2006).
Estes organismos vêm ganhando crescente atenção por sua capacidade de gerar uma
grande variedade de compostos naturais bioativos, também conhecidos como metabólitos
secundários de cianobactérias, os quais são fonte de uma vasta gama de produtos para as
indústrias de ração animal, alimentos, cosméticos, farmacêuticos e nutracêuticas (Otero &
Vincenzini, 2003; Cepoi et al., 2009; Moore, 1996).
Cianobactérias e microalgas também possuem grande potencial para a produção de
biocombustíveis, por meio do aproveitamento de lipídios produzidos por estes microorganismos (Angermayr et al., 2009), bem como a produção direta de etanol.
O hidrogênio é uma promissora fonte de energia “limpa”, contudo sua produção ainda é
cara e laboriosa, o que inviabiliza sua utilização quando comparado com os combustíveis
fósseis. A possibilidade de captar gás hidrogênio ao mesmo tempo em que se realiza
fotossíntese, e talvez outros processos de biorremediação, permitiria o barateamento e a
disseminação dessa alternativa energética (Dodds P. & McDowall W., 2012). Nesse sentido é
essencial identificar lipases mais eficientes e hidrogenases tolerantes à O2. Dessa forma, este
projeto visa investigar através da bioprospecção de linhagens já isoladas pelo laboratório a
presença de genes codificantes de enzimas envolvidas na produção de biodiesel e
biohidrogênio.
JUSTIFICATIVA
Segundo Rittmann (2008), a dependência de combustíveis fósseis representa três
grandes riscos para a sobrevivência da sociedade humana: (i) o esgotamento das reservas de
combustíveis fósseis; (ii) disputas geopolíticas, devido a diminuição dos recursos, podendo
levar a perturbações econômicas e de energia, instabilidade política e guerra; e (iii) ocorrência
de mudanças climáticas globais causadas pelo aumento do CO 2 atmosférico devido à
combustão dos combustíveis fósseis.
Embora o presságio de uma catástrofe possa parecer mais imediato para os dois
primeiros riscos, é o terceiro, que terá o maior, mais duradouro e profundo impacto. Contudo,
2
ainda é possível reduzi-lo ou até mesmo eliminá-lo através da utilização de fontes renováveis
de energia que supram os serviços energéticos, até então, obtidos a partir de combustíveis
fósseis (Rittmann, 2008). Assim, eliminando esse terceiro risco os outros dois seriam
consequentemente minimizados.
Nos últimos anos, várias tecnologias têm sido implementadas com o objetivo de substituir
os combustíveis fósseis, principalmente através da produção viável de combustíveis líquidos,
tais como os ésteres de ácidos graxos ou biodiesel (Kalscheuer et al., 2006), alcanos (Schirmer
et al., 2010), e alcoóis superiores de fontes renováveis (Bond-Watts et al., 2011). Contudo, a
maioria destes processos biológicos tem como grande desvantagem, a dependência de
microrganismos que metabolizam fontes de carboidratos de matérias-primas cultivadas em
terras potencialmente férteis, como por exemplo, a cana-de-açúcar.
Essa competição com o uso da terra para culturas alimentares resulta em aumento do
custo de alimentos (Scharlemann & Laurance, 2008). Além disso, a produção de
biocombustíveis a partir de culturas agrícolas como a cana-de-açúcar, por exemplo, pode
causar um grande impacto ambiental em comparação com os combustíveis fósseis, visto que o
desmatamento provoca a emissão de grandes quantidades de gases de efeito estufa - GEE.
Finalmente, os fertilizantes nitrogenados, muitas vezes usados para cultivar plantas, são uma
fonte conhecida de óxido nitroso, um GEE que destrói o ozônio estratosférico (Scharlemann &
Laurance, 2008).
Atualmente existem duas possibilidades com potencial para a geração de energia
(carbono neutro) renovável, em grandes quantidades, uma delas utiliza painéis solares
fotovoltaicos para converter a energia da luz do sol em energia elétrica e a outra utiliza
materiais como biomassa arborícola, sobra de serragem, vegetais e frutas, bagaço de cana e
alguns tipos de esgotos, que são então transformados em energia por meio dos processos de
combustão, gaseificação, fermentação ou na produção de substâncias líquidas. Esta energia
renovável, ou bioenergia, pode ser convertida em três produtos: eletricidade, calor e
combustíveis.
A energia de biomassa pode ser diferenciada pela forma de biomassa utilizada, isto é,
culturas alimentares, biomassa complexa, microrganismos, etc., e pela energia final resultante,
isto é, etanol, butanol, metano, hidrogênio, eletricidade ou biodiesel.
Rittman et al. (2008) descreve dois princípios comuns a todas as abordagens de
bioenergia: (i) a energia está nos elétrons, e todos os produtos de processos bioenergéticos
consistem em portadores de elétrons em alta densidade, sendo alguns orgânicos como o
etanol, metanol e biodiesel e outros inorgânicos como o gás hidrogênio e a eletricidade; e (ii) a
3
melhor fonte de energia é a luz solar, isto é, organismos através da fotossíntese captam a
energia do sol e a investem em moléculas orgânicas que são portadoras de elétrons.
A conversão direta da energia solar em combustível líquido usando microrganismos
fotossintéticos é uma atraente alternativa para os combustíveis fósseis, e como vantagens do
uso de organismos tais como microalgas e cianobactérias pode-se citar: (i) a disponibilidade de
ferramentas de manipulação genética; (ii) taxa de crescimento mais elevada em comparação
com aquela das plantas; e (iii) capacidade de crescimento em áreas não adequadas para a
agricultura. A utilização destes organismos pode proporcionar uma forma de resolver o conflito
potencial entre o uso da terra para a produção de alimentos ou para a produção de bioenergia
(Machado & Atsumi, 2012).
As microalgas e as cianobactérias proporcionam vantagens potenciais para os
biocombustíveis derivados de lipídios devido à sua grande capacidade para converter dióxido
de carbono em lipídios ricos em carbono, sem competir por terra arável necessária para as
culturas agrícolas de plantas oleaginosas (Machado & Atsumi, 2012), e o desenvolvimento da
engenharia de bioprocessos em adição ao maior conhecimento de sua fisiologia tem
pavimentado o caminho para a sua utilização em aplicações de bioenergia. Contudo, um dos
grandes desafios biológicos associados à pesquisa relacionada à produção de bioenergia a
partir de microalgas e/ou cianobactérias é a identificação e otimização do cultivo de linhagens e
espécies com atributos "ótimos", que são definidos como uma combinação favorável de
características, a saber: elevadas taxas de crescimento, elevado teor de lipídios e facilidade de
colheita e isolamento dos produtos gerados (Greenwell et al., 2010, Wijffels & Barbosa, 2010).
Nesse sentido, a natureza dos projetos de bioenergia de microalgas e/ou cianobactérias
requer uma abordagem multidisciplinar envolvendo engenheiros, biólogos e químicos, isto é,
enquanto os engenheiros têm foco na projeção de aparatos para a otimização de cultivo, os
biólogos e químicos focam na seleção de espécies e linhagens, na caracterização molecular
das vias metabólicas de produção de biocombustíveis e na manipulação genética tanto destas
vias como naquela de fixação e armazenamento de carbono.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar o potencial de cianobactérias da Amazônia Oriental para a produção de enzimas
com potencial utilização na produção de bioenergia.
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Objetivos Específicos
1. Avaliar o potencial de cianobactérias da Amazônia Oriental para a produção de
hidrogênio molecular;
2. Avaliar o potencial de cianobactérias da Amazônia Oriental para a produção de lipases;
3. Identificar as linhagens mais promissoras;
4. Avaliar as relações filogenéticas das linhagens em comparação com aquelas descritas
na literatura.
MATERIAIS E MÉTODOS
O desenvolvimento do trabalho foi baseado na análise de algumas linhagens
selecionadas entre as 68 linhagens cianobacterianas da Coleção de Cianobactérias e
Microalgas (CACIAM) do Laboratório de Tecnologia Biomolecular/UFPA. As linhagens foram
isoladas do Lago Bolonha, um dos reservatórios de água que abastecem a região
metropolitana de Belém, do reservatório da UHE Tucuruí, do rio Pará no Estado do Pará e de
rios no estado do Amapá.
O DNA total das linhagens foi extraído de acordo com Lin et al. (2010) com modificações.
As celulas foram lisadas com tampão de lise (100mM Tris, 10mM de NaCl, 1mM de EDTA
(ácido etileno diamono tetracético) a pH 9,0 e
lisozima (20mg/mL). As amostras foram
incubadas a 37ºC por 30 minutos. Após este período, adicionou-se RNAse (10mg/mL),
proteinase K (20mg/mL), SDS 10% e novamente incubados a 55ºC por 1 ou 2 horas. A
extração seguiu, adicionando-se CIA (Clorofórmio-Álcool-Isoamil) (24:1) e centrifugando por 5
minutos a 14000 RPM. Para a precipitação do DNA foi adicionado acetato de sódio (3M e pH
4,8) e um volume de isopropanol. Para confirmação da extração, o DNA foi migrado em gel de
agarose 1.5%, por 22 minutos, tendo sido aplicados 4μL de DNA de cada amostra. As
amostras foram então acondicionadas em freezer a -20ºC.
Para a detecção do potencial de produção de biohidrogênio, foram testadas algumas
linhagens para a presença de um fragmento dos genes hydA (~1935 pb), hoxH (~1431 pb) e
hupS (~1083 pb), os quais estão envolvidos na síntese da enzima hidrogenase de acordo com
os protocolos descritos por Boyd et al. (2009), Barz et al. (2010) e Roeselers et al. (2008),
respectivamente.
Também
foi
testado
a
presença
do
gene nifH, da enzima nitrogenase, utilizando os protocolos descritos por Zehr & McReynolds
(1989) e Singh et al. (2013).
5
Para o gene hydA o protocolo descrito por Boyd et al. (2009) foi modificado.
Aproximadamente 50ng de DNA foi utilizado em cada reação de PCR de 15 μL, cada mix de
PCR continha 100 µM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2, 5.0 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de
Taq DNA polimerase (Invitrogen, CA, EUA) e tampão de reação 10x. O programa de
amplificação consistiu em desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a
95ºC por 40s, 56.5ºC por 40s, 72ºC por 55s, e um período de extensão final a 72ºC por 5
minutos.
Para o gene hoxH o protocolo descrito por Barz et al. (2010) foi modificado conforme
descrito a seguir. Aproximadamente 50 ng de DNA foi utilizado em cada reação de PCR de 15
μL, cada mix de PCR continha 100 µM de dNTPs, 2.0 mM de MgCl2, 5.0 μM de cada
oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, CA, EUA) e tampão de reação 10x. O
programa de amplificação consistiu em desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de
35 ciclos a 95ºC por 45s, 61.5ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto e 15 segundos, e um período
de extensão final a 72ºC por 10 minutos.
Para o gene hupS o protocolo descrito por Roeselers et al. (2008) foi modificado.
Aproximadamente 50 ng de DNA foi utilizado em cada reação de PCR de 15 μL, cada mix de
PCR continha 100 µM de dNTPs, 2.0 mM de MgCl2, 5.0 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de
Taq DNA polimerase (Invitrogen, CA, EUA) e tampão de reação 10x. O programa de
amplificação consistiu em desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a
94ºC por 1 minuto, 49.6ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto, e um período de extensão final a
72ºC por 7 minutos.
Para o gene nifH o protocolo descrito em Singh et al. (2012) foi modificado, e para facilitar
a identificação das reações, este teste foi nomeado nifH++. Aproximadamente 50 ng de DNA
foi utilizado em cada reação de PCR de 20 μL, cada mix de PCR continha 80 µM de dNTPs,
1.6 mM de MgCl2, 5.0 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen,
CA, EUA) e tampão de reação 10x. O programa de amplificação consistiu em desnaturação
inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94ºC por 1 minuto, 54ºC por 1 minuto, 72ºC
por 1 minuto, e um período de extensão final a 72ºC por 7 minutos.
Para o gene nifH o protocolo descrito por Zehr & McReynolds (1989) foi modificado.
Aproximadamente 50 ng de DNA foi utilizado em cada reação de PCR de 25 μL, cada mix de
PCR continha 100 µM de dNTPs, 2.0 mM de MgCl2, 5.0 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de
Taq DNA polimerase (Invitrogen, CA, EUA) e tampão de reação 10x. O programa de
amplificação consistiu em desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos a
6
95ºC por 15 segundos, 48ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto, e um período de extensão
final a 72ºC por 5 minutos.
Os produtos das PCRs de cada gene foram purificados com AxyPrep™ DNA Gel
Extraction Kit (Axygen, USA) e em seguida sequenciados no analisador automático de DNA
ABI 3730 (Applied Biosystems, USA). As sequências obtidas foram alinhadas pela ferramenta
ClustalW e editadas manualmente no programa BioEdit (Hall, 2011) e submetidas ao banco de
dados do NCBI utilizando a ferramenta Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para
comparações de homologias e obtenção das sequências mais próximas para a construção de
arvores filogenéticas. As análises filogenéticas foram realizadas no software Mega V6 com
1000 replicatas de Bootstrap, utilizando-se o método de Neighbor Joining (NJ) (Saitou & Nei,
1987). As distâncias evolucionárias foram computadas usando o método de kimura-2parâmetros ou de “p-distance”. Foi então possível construir duas árvores filogenéticas, uma
para o gene HoxH e outra para o gene nifH.
RESULTADOS
A partir da amplicação dos genes testados foi possivel construir a Tabela 1 e analisar
quais linhagens apresentam a provável presença dos genes alvo.
Tabela 1. Resultados da amplificação para os genes de hidrogenase (hoxH e HupS) e
nitrogenase (nifH e nifH++)
Linhagem
Gene hoxH
CACIAM
03
(Mycrocistis
Gene hupS Gene nifH
Gene nifH++
--
--
--
+
CACIAM 05 (Synechocystis sp.)
+
--
--
+
CACIAM 06 (Cyanobium gracile)
+
--
--
--
CACIAM 07 (Lyngya sp.)
+
--
+
--
CACIAM 14 (Cyanobium sp.)
--
+
--
--
CACIAM 16 (Cyanobium sp.)
--
--
+
+
--
+
+
--
CACIAM21 (Nostoc sp.)
--
+
+
--
CACIAM 23 (Lyngya sp.)
--
+
+
+
aeruginosa)
CACIAM
19
(Anabaena
flos
aquae)
7
CACIAM 28
--
--
+
+
CACIAM 30
--
--
--
+
*CACIAM: Coleção Amazônica de Cianobactérias e Microalgas
A figura 1A, mostra a resposta positiva para a amplificação do gene hoxH nas linhagens
de CACIAM 05, 06, 07 e 23. Segundo Barz et al, o gene hoxH amplifica em torno de 1190 pares
de bases. A figura 1B demonstra os resultados obtidos para o gene hupS, o qual foi favorável
para CACIAM 07, 14, 19 e 21. Segundo Roeselers et al (2008), as bandas deveriam apresentar
peso molecular de aproximadamente 286 pares de base, porém CACIAM 07 apresentou uma
banda em torno de 400 pares de bases e outra em torno de 700, já CACIAM 14 apenas uma
banda com cerca de 700 pares de bases e para CACIAM 19 e 21 bandas em torno de 400
pares de bases.
1A
1B
Figura 1. Gel de agarose com o resultado de amplificação dos genes hoxH (1A) e hupS (1B).
L: Peso Molecular em pares de bases; (-) Controle negativo.
8
A obtenção de amplificações dos genes hoxH e hupS significa que a coleção possui
linhagens detentoras de enzimas hidrogenases do tipo bidirecional e/ou de captação de H+,
respectivamente.
Em relação ao gene hydA não conseguimos obter produtos de PCR com a especificidade
e qualidade necessária. Tal dificuldade, acreditamos, deve-se ao fato do primer possuir alto
valor de degeneração, apresentando degeneração de 432 para o primer hydA-F e 864 para o
hydA-R, tornando a amplificação do gene pouco eficiente, principalmente em amostras
complexas como as de culturas não axênicas. É importante ressaltar que este primer é voltado
principalmente para bactérias não pertencentes ao grupo das cianobactérias, e, portanto, sua
aplicação visa principalmente detectar contaminantes que possuam a capacidade de utilizar
hidrogênio.
Os produtos de PCR dos três genes testados (hoxH, hupS, nifH e nifH++) foram
purificados, e o resultado e análise dos mesmos pode ser observado na figura 2. A figura 2A
apresenta a purificação para o gene hoxH das linhagens CACIAM 05,06,07 e 23; o resultado
significa que a amplificação para o gene de hidrogenase bidirecional está presente nas
linhagens de Synechocystis sp, Cyanobium gracile e Lyngya sp. A figura 2B referente ao gene
hupS para as linhagens CACIAM 14,19,21 e 23 demonstra a amplificação para o gene de
captação da hidrogenase nas linhagens Cyanobium sp., Anabaena flos aquae, Nostoc sp.,
Lyngya sp., respectivamente. Na figura 2C, o gene nifH, com purificação das linhagens
CACIAM 07,16,19,21,23 e 28. A amplificação para o gene de nitrogenase está presente nas
linhagens de Lyngya sp., Cyanobium gracile, Anabaena flos aquae, e Nostoc sp. E por fim, a
figura 2D apresenta o gene nifH++ , nas linhagens CACIAM 16,28 e 30; confirmando a
amplificação para o gene de nitrogenase nas linhagens de Cyanobium gracile, CACIAM 28 e
CACIAM 30.
9
2A
2C
2B
2D
Figura 2. Resultado da purificação dos produtos de PCR. (A) Purificação do gene hoxH das linhagens CACIAM
05,06,07 e 23. (B) Purificação do gene hupS das linhagens CACIAM 14,19,21 e 23. (C) Purificação do gene nifH
das linhagens CACIAM 07,16,19,21,23 e 28. (D) Purificação do gene nifH++ das linhagens CACIAM 16,28 e 30.
Em seguida, os purificados foram submetidos ao analisador automático de DNA ABI 3730
(Applied Biosystems USA). Um resultado preliminar foi analisado, com auxílio da ferramenta
blastn, no banco de dados do NCBI, e registrado em três tabelas (tabelas 2 a 4), tal proposição
foi realizada devido à reduzida qualidade das sequencias. Nestes dados estão inclusas as
análises dos genes nifH, responsável por produzir hidrogênio molecular a partir da fixação de
nitrogênio.
As tabelas apresentam as linhagens nas quais houve sequencias com qualidade
suficiente para alinhamento. Na mesma é representada a correspondência de tal alinhamento,
o número de acesso da linhagem do banco de dados NCBI e a identidade da sequência
analisada correspondente a sequencia do banco de dados. A Tabela 2 demonstra a análise
das linhagens CACIAM 05,07 e 23, para o gene hoxh. CACIAM 05 possui correspondência
para Synechocystis sp. PCC 6803, com 93% de identidade na sequência Foward (F) e 95% na
Reverse (R). CACIAM 07 e CACIAM 23 apresentaram 68% e 69% de identidade para Lyngbya
majuscula CCAP 1446/4 na sequência F e 75% e 74% na R. A Tabela 3 demonstra a análise
10
das linhagens CACIAM 14,19,21 e 23, para o gene hupS. CACIAM 14 apresentou 90% de
identidade para Nostoc sp. PCC 7422 na sequência R, devido a problemas no sequenciamento
não foi possível encontrar dados significativos para a sequência Foward. CACIAM 19 e 21
também apresentaram correspondência para Nostoc sp. PCC 7422 com identidade de 89% e
86% para a sequência F e 90% para a R em ambas as linhagens. CACIAM 23 apresentou
correspondência para Nostoc sp. PCC 7107com identidade de 82% para F e 75% para a R. A
Tabela 4 representa a análise das linhagens CACIAM 07,19,21 e 23, para o gene nifH.
CACIAM 07 e 23 apresentaram 96% e 99% de identidade para clone EPNCF1-8 NifH de
bactéria não cultivável na sequência F e 98% R para ambas, CACIAM 19 apresentou 86% de
identidade para Anabaena sp. L-31 NifU (nifU) gene na sequência F e 91% na R. E CACIAM 21
apresentou 92% de identidade para clone nifH31 dinitrogenase reductase (nifH) de bactéria
não cultivável na sequência F e 93% na R.
Tabela 2. Análise das linhagens CACIAM 05,07 e 23, para o gene hoxH
Linhagem LTB
Gene hoxH
CACIAM 05F
CACIAM 05R
CACIAM 07F
CACIAM 07R
CACIAM 23F
CACIAM 23R
Alinhamento- blastn-NCBI
Nº de acesso
Identidade
Referência
Synechocystis sp. PCC 6803
CP003265
93%
95%
68%
75%
69%
Trautmann, D.et al
74%
Tamagnini,P. et al
Lyngbya
1446/4
Lyngbya
1446/4
majuscula
CCAP AY536043
majuscula
CCAP AY536043
Tamagnini,P. et al
Tabela 3. Análise das linhagens CACIAM 14,19,21 e 23, para o gene hupS
Linhagem LTB
Gene hupS
CACIAM 14R
CACIAM 19F
CACIAM 19R
CACIAM 21F
CACIAM 21R
Alinhamento- blastn-NCBI
CACIAM 23F
CACIAM 23R
Nostoc sp. PCC 7107
Nº de acesso
Nostoc sp. PCC 7422 hupS,
hupL genes para a pequena
subunidade da hidrogenase de AB237640
captação
CP003548
Identidade Referência
90%
89%
90%
86%
90%
82%
75%
Yoshino, F. et al.
Gugger,M. et al.
Tabela 4. Análise das linhagens CACIAM 07,19,21 e 23, para o gene nifH
Linhagem LTB
Gene nifH
CACIAM 07F
CACIAM 07R
Alinhamento- blastn-NCBI
CACIAM 19F
Anabaena sp. L-31 NifU (nifU) L04499
Clone EPNCF1-8 NifH
bactéria não cultivável
Nº de acesso
de DQ142685
Identidade Referência
96%
98%
Jasrotia,P. e Ogram,A.
86%
Murphy,S.T.,
11
CACIAM 19R
gene
91%
Jackman,D.M.
Mulligan,M.E.
CACIAM 21F
CACIAM 21R
Clone nifH31 dinitrogenase JN162465
reductase (nifH) de bactéria
não cultivável
92%
93%
Keshri,J., Mishra,A. e
Jha,B.
CACIAM 23F
CACIAM 23R
Clone EPNCF1-8 (NifH)
bactéria não cultivável
99%
98%
Jasrotia,P. e Ogram,A.
de DQ142685
e
Infelizmente, a qualidade do sequenciamento não permitiu a utilização das sequências
amplificadas para a análise filogenética. Foram então obtidas sequências dos genes hoxH e
nifH a partir de resultados de sequenciamento genômico de 3 linhagens do laboratório (dados
não fornecidos). Após edição e alinhamento das sequências foram montadas as árvores
filogenéticas utilizando-se as sequências dos genes hoxH (Figura 3) e nifH (Figura 4). O gene
hoxH encontrado nas linhagens CACIAM 05 e CACIAM 14 agruparam com alto valor de
Bootstrap, assim como o gene nifH encontrado nas linhagens CACIAM 19 e 23. Apenas a
sequência 23 é proveniente dos dados do sequenciamento, as outras sequências são do banco
de dados do Laboratório de Tecnologia Biomolecular (LTB) e foram trabalhadas com os
devidos genes, pois como anteriormente comentado, o sequenciamento não apresentou boa
resolução.
CACIAM 05 se agrupa no mesmo ramo de Synechocystis sp., caracterizada por
apresentar hidrogenases [NiFe] e elevada produção de hidrogênio molecular (Cano, M. et
al.,2014). Já a linhagem CACIAM 14 agrupa-se no ramo de Aphanothece halophytica, uma
cianobactéria halotolerante capaz de produzir até quatro vezes mais hidrogênio molecular
quando comparada a outras linhagens (Taikhao et al.,2012) e próximo a linhagens de
Anabaena siamensis, caracterizada por possui elevada capacidade de produção de hidrogênio
molecular sob fixação de nitrogênio e sob condições de estresse (Khetkorn et al., 2010) e
Spirulina subsulsa.
Para o gene nifH, a linhagem CACIAM 19 se agrupa no clado de Westiellopsis sp Ind 20,
Calothric brevíssima Ind 10 e Anabaena sp Ind 6, as quais são cianobactérias heterocísticas e
produzem hidrogênio molecular por meio da fixação de nitrogênio. A árvore filogenética sugere
que possuem a mesma origem quando relacionada ao gene estudado. Em CACIAM 23 as
linhagens agrupadas são Oscillatoria sp. e Nostoc sp., também cianobactérias filamentosas
heterocísticas, caracterizadas por fixar nitrogênio e produzir hidrogênio molecular. A atividade
12
da nitrogenase é influenciada por determinados fatores, como: (i) a luminosidade que é um
fator determinante devido ao requerimento de ATP, a energia proveniente do ATP é
fundamental para o transporte eletrônico durante a produção de hidrogênio; (ii) a migração de
carboidratos para os heterócitos a fim de reduzir a influência do oxigênio na inativação da
nitrogenase; (iii) e a presença de amônia, responsável por efeitos negativos na síntese da
nitrogenase, reduzindo significantemente a produção de hidrogênio molecular (Lindenberg et
al., 2004).
Em relação à amplificação das enzimas lipases envolvidas na produção de biodiesel, não
foi possível começar este processo devido a dificuldades operacionais nos passos anteriores,
principalmente relacionadas ao sequenciamento das amostras.
Figura 3: Árvore filogenética baseada no método de Neighbor-joining (1000 replicatas de boostrap) revelando a
homologia das sequências de nucleoídeos do gene hoxH das linhagens CACIAM 05 e 14, em comparação com as
linhagens depositadas no banco de dados do GenBank. Produzida no Software MEGA V6. As linhagens CACIAM
05 e 14 estão identificadas com losangos vermelhos (
)e são sequências do Laboratório de Tecnologia
Biomolecular (LTB).
13
Westiellopsis sp. Ind20 dinitrogenase reductase (nifH)
Calothrix brevissima Ind10 dinitrogenase reductase (nifH)
CACIAM 19 nifH
Anabaena sp. Ind6 dinitrogenase reductase (nifH)
Tolypothrix sp. (2 seqs.)
Anabaena sp. (5 seqs.)
Fischerella sp. Ind81 dinitrogenase reductase (nifH)
Mastigocladus laminosus Ind29 dinitrogenase reductase (nifH)
Cylindrospermum sp. (3 seqs.)
Fischerella sp. Ind26 dinitrogenase reductase (nifH)
Nostochopsis sp. Ind28 dinitrogenase reductase (nifH)
Hapalosiphon sp. (3 seqs.)
Nostoc Calcicola (2 seqs.)
Anabaenopsis sp. Ind8 dinitrogenase reductase (nifH)
Nostoc sp. Ind37 dinitrogenase reductase (nifH)
Scytonema sp. (3 seqs.)
Nostoc sp. (5 seqs.)
CACIAM 23 nifH
Nostoc sp. PCC 7120 dinitrogenase reductase (nifH)
Nostoc spongiaeforme Ind42 dinitrogenase reductase (nifH)
Nostoc calcicola Ind30 dinitrogenase reductase (nifH)
Oscillatoria sp. PCC 6506 NifH
Uncultured Fischerella sp. clone 2CFF47 dinitrogenase reductase (nifH)
Cylindrospermum muscicola Ind12 nitrogenase iron protein (nifH)
Nostoc sp. Ind40 dinitrogenase reductase (nifH)
Westiellopsis sp. Ind19 dinitrogenase reductase (nifH)
Calothrix sp. (3 seqs.)
Azospirillum brasilense NifH
Figura 4: Árvore filogenética baseada no método de Neighbor-joining (1000 replicatas de boostrap) revelando a
homologia das sequências de aminoácidos do gene nifH das linhagens CACIAM 19 e 23, em comparação com as
linhagens depositadas no banco de dados do GenBank. Produzida no Software MEGA V6. CACIAM 19 e 23
estão identificadas com losangos vermelhos (
) e são sequências do Laboratório de Tecnologia Biomolecular
LTB.
14
CONCLUSÃO
A amplificação do gene hoxH foi bem sucedida em quatro linhagens cianobacterianas.
Para o gene hupS houve resposta positiva também para quatro linhagens, para o gene nifH
foram seguidos dois protocolos, para Zehr & McReynolds (1989) o gene apresentou seis
amplificações e para o protocolo segundo Sigh et al. (2012)
apresentou três respostas
positivas. Porém para o gene hydA ainda não foram encontradas respostas positivas.
O estudo filogenético dos genes hoxH e nifH constatou a presença de linhagens
cianobacterianas produtoras de hidrogenase nos clados próximos. Tais cianobactérias são
caracterizadas por apresentar eleveda produção de hidrogênio sob condições extremófilas, no
caso do gene hoxH. E para o gene nifH são caracterizadas por fixar nitrogênio em heterócitos,
ou na célula vegetal, e produzir hidrogênio molecular a partir do mesmo.
É importante ressaltar que este trata-se de um dos primeiros estudos a analisar a
diversidade de genes envolvidos com a produção de bioenergia em linhagens bacterianas da
Amazônia. Tais resultados, ainda que preliminares, demonstram a potencialidade da
descoberta de novas enzimas que poderiam ser utilizadas na geração através de fontes
alternativas de bioenergia.
15
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19
DIFICULDADES: Os protocolos de sequenciamento estão sendo otimizados, por tal motivo,
houve uma perda significante de informação das amostras purificadas.
PARECER DO ORIENTADOR: A aluna realizou suas atividades com responsabilidade,
dedicação e excelência.
DATA: 10/08/2015
_________________________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________
ASSINATURA DO ALUNO
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