GLP-1 sezernierende mesenchymale

Transcrição

Aus dem Institut für Versuchstierkunde und Zentralen Tierlaboratorium
der Medizinischen Hochschule Hannover
und dem International Neuroscience Institute Hannover
GLP-1 sezernierende mesenchymale
alginatverkapselte Stammzellen zur Neuroprotektion
nach
Schädel-Hirn-Trauma
INAUGURAL -DISSERTATIO N
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Pia Rittmann
aus Dortmund
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Hans J. Hedrich
Prof. Dr. Thomas Brinker
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Hans J. Hedrich
2. Gutachter:
Tag der mündlichen Prüfung:
Fördernde Institution:
Internationale Stiftung Neurobionik Hannover
Meinen Eltern
und
meinem Bruder Jens
gewidmet
Abkürzungsverzeichnis:
AK
Antikörper
Aqua dest.
destilliertes Wasser
BB
Beam Balance Test
BSA
Bovines Serum Albumin
BW
Beam Walking Test
CCI
Controlled Cortical Impact
CO2
Kohlenstoffdioxid
DAB
Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
EtOH
Ethanol
GFAP
Saures Gliafaserprotein, Glial fibrillary acidic Protein
GLP-1
Glucagon-like Peptide-1
H2O2
Wasserstoffperoxid
HCl
Salzsäure
HP
Hidden Platform Version
H.E.
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
i.c.v.
intrazerebroventrikulär
i. p.
intraperitoneal
kD
Kilo Dalton
KGW
Körpergewicht
KH2PO4
Kaliumdihydrogenphosphat
m
molar
MAP-1
Microtubule-associated Protein-1
MAPK
Mitogen-activated Protein Kinase
MEZ
Mitteleuropäische Zeit
MHH
Medizinische Hochschule Hannover
MSC
Mesenchymale Stammzellen
hMSC
Humane mesenchymale Stammzellen
MtOH
Methanol
µ
Mikro
MWM
Morris Water Maze Test
Na2HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl
Kochsalz
NGS
Normal Goat Serum
NRS
Normal Rat Serum
NSS
Normal Swine Serum
O2
Sauerstoff
OT
Objektträger
OX6
MHC Typ II Oberflächenantigen auf der Mikroglia
p
Piko
PBS
Phosphatpuffer
PFA
Paraformaldehyd
PI3K
Phosphatidylinositol-3-Kinase
PKA
Proteinkinase A
RT
Raumtemperatur
SD
Standardabweichung
SEM
Standardfehler
SHT
Schädel-Hirn-Trauma
SP
Spatial Probe
SPF
Spezifisch Pathogenfrei
StreptABKomplex
Streptavidin Biotinylierte Meerrettich Peroxidase
TBI
Traumatic Brain Injury
VP
Visible Platform Version
Ztm
Zentrales Tierlaboratorium der MHH
1 Einleitung ___________________________________________________ 1
2 Literaturübersicht _____________________________________________ 3
2.1 Schädel-Hirn-Trauma _____________________________________________ 3
2.1.1 Einführung __________________________________________________________3
2.1.2 Pathophysiologische Grundlagen ________________________________________5
2.1.3 Mechanismen der Zellschädigungen ______________________________________5
2.1.4 Klinisch-therapeutische Konsequenzen ____________________________________7
2.2 Neuroprotektion _________________________________________________ 9
2.2.1 Einführung __________________________________________________________9
2.2.2 Therapieansätze _____________________________________________________9
2.3 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma ______________________________ 11
2.4 Controlled Cortical Impact (CCI) ___________________________________ 13
2.5 Glucagon-like Peptide-1 __________________________________________ 14
2.5.1 Einführung _________________________________________________________14
2.5.2 Rezeptor __________________________________________________________16
2.5.3 Wirkungen _________________________________________________________18
2.5.4 Therapeutischer Einsatz ______________________________________________20
2.6 Mikroverkapselung ______________________________________________ 23
2.6.1 Einführung _________________________________________________________23
2.6.2 Verkapselungsmaterial: Alginat _________________________________________26
2.6.3 Therapeutischer Einsatz ______________________________________________28
2.7 Ziel der vorliegenden Arbeit_______________________________________ 31
3 Material und Methoden________________________________________ 32
3.1 Tiere __________________________________________________________ 32
3.1.1 Herkunft ___________________________________________________________32
3.1.2 Haltung und Fütterung ________________________________________________32
3.1.3 Narkose und Analgesie _______________________________________________34
3.2 Implantate: CellBeads® ___________________________________________ 34
3.2.1 Herkunft ___________________________________________________________34
3.2.2 Verkapselungstechnik ________________________________________________35
3.3 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen _________________________ 37
3.3.1 Biokompatibilitätsuntersuchung _________________________________________37
®
3.3.1.1 Gruppe I: Implantation leerer CellBeads ______________________________38
®
3.3.1.2 Gruppe II: Implantation von CellBeads mit xenogener Zelllinie ____________38
3.3.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma ____________39
3.3.2.1 Gruppe I: Kontrolltiere ____________________________________________40
3.3.2.2 Gruppe II: Trauma (CCI)___________________________________________41
®
3.3.2.3 Gruppe III: Trauma (CCI) und Implantation leerer CellBeads ______________41
®
3.3.2.4 Gruppe IV: Trauma (CCI) und Implantation GLP-1 CellBeads _____________41
3.4 Versuchsdurchführung __________________________________________ 42
3.4.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation __________________________________42
3.4.2 Behandlung der CellBeads® vor Implantation ______________________________42
3.4.3 Stereotaktische Implantationstechnik_____________________________________43
3.4.4 Controlled Cortical Impact (CCI) ________________________________________46
®
3.4.5 Explantation der CellBeads nach Langzeitimplantation _____________________48
3.4.6 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads® _________________________49
3.4.7 Liquorpunktion ______________________________________________________50
3.4.8 Liquoruntersuchung __________________________________________________51
3.4.9 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung ______________________51
3.4.9.1 Beam Balance Test ______________________________________________52
3.4.9.2 Beam Walking Test ______________________________________________53
3.4.9.3 Morris Water Maze Test ___________________________________________54
3.5 Neuropathologische Untersuchungen ______________________________ 57
3.5.1 Transkardiale Perfusion _______________________________________________57
3.5.2 Fixierung __________________________________________________________58
3.5.3 Kryobehandlung_____________________________________________________58
3.5.4 Gefrierschnitte ______________________________________________________58
3.5.5 Färbungen _________________________________________________________59
3.5.5.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)___________________________________59
3.5.5.2 Nissl-Färbung ___________________________________________________60
3.5.6 Immunhistologie_____________________________________________________61
3.5.6.1 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) ____________________________________63
3.5.6.2 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1) _____________________________64
3.5.6.3 Gliafaserprotein (GFAP) ___________________________________________64
3.5.6.4 MHC Typ II Oberflächenantigen (OX6)________________________________65
3.5.7 Mikroskopische Auswertung ___________________________________________65
3.5.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)___________________________________66
3.5.7.2 Nissl-Färbung ___________________________________________________67
3.5.7.6 MHC Typ II Oberflächenantigen (OX6)________________________________71
3.6 Statistische Auswertung _________________________________________ 73
4 Ergebnisse _________________________________________________ 74
4.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ___________________________________ 74
4.1.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation __________________________________74
4.1.2 Untersuchung der Umgebungsreaktion ___________________________________75
®
4.1.3 Explantation der CellBeads nach Langzeitimplantation ______________________80
4.1.4 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads® _________________________81
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma_____ 82
4.2.1 H.E.-Färbung: Histologischer Nachweis der Implantate_______________________82
4.2.2 Liquoruntersuchung: Nachweis der Proteinfreisetzung _______________________84
4.2.3 H.E.-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma _______________________86
4.2.4 Nissl-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma _______________________89
4.2.5 Immunhistologie_____________________________________________________91
4.2.5.4 MHC Typ II Oberflächenantigen (OX6)_______________________________101
4.2.6 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung _____________________105
4.2.6.1 Beam Balance Test _____________________________________________105
4.2.6.2 Beam Walking Test _____________________________________________110
4.2.6.3 Morris Water Maze Test __________________________________________114
5 Diskussion_________________________________________________ 119
5.1 Diskussion Methodik ___________________________________________ 119
5.1.1 Tierexperimentelles Modell ___________________________________________119
®
5.1.1.1 Zerebrale Implantation von CellBeads ______________________________120
5.1.1.2 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma (CCI) __________________________121
5.1. 2 Untersuchungsmethoden ____________________________________________122
5.1. 2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ____________________________________122
5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma __________123
5.2 Diskussion Ergebnisse__________________________________________ 127
5.2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung ________________________________________127
5.2.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma ___________129
5.2.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate______________________________129
5.2.2.2 Untersuchung der Proteinfreisetzung ________________________________130
5.2.2.3 Morphologische Befunde nach Trauma ______________________________131
5.2.2.4 Immunhistologie ________________________________________________133
5.2.2.5 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung _________________135
5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ________________________________ 137
6 Zusammenfassung __________________________________________ 138
7 Summary __________________________________________________ 140
8 Literaturverzeichnis _________________________________________ 142
9 Anhang ___________________________________________________ 162
9.1 Bezugsquellen_________________________________________________ 162
9.1.1 Versuchstiere______________________________________________________162
9.1.2 OP-Bedarf ________________________________________________________162
9.1.3 Verbrauchsmaterialien: Histologie und Immunhistologie _____________________164
9.1.4 Geräte und Software ________________________________________________167
9.2 Reagenzien ___________________________________________________ 169
9.3 Färbeprotokolle ________________________________________________ 171
9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung _____________________________ 175
9.4.1 Protokoll: Operation _________________________________________________175
9.4.2 Protokoll: Gefrierschneidetechnik ______________________________________176
9.4.3 Protokoll: Beam Balance Test _________________________________________177
9.4.4 Protokoll: Beam Walking Test _________________________________________178
9.4.5 Protokoll: Morris Water Maze Test______________________________________179
9.5 Statistik ______________________________________________________ 181
9.5.1 Deskriptive Statistik _________________________________________________181
9.5.2 Statistisches Testverfahren: Fischer-Test ________________________________187
9.6 Danksagung___________________________________________________ 192
1 Einleitung
1
1 Einleitung
Das Schädel-Hirn-Trauma entsteht im Rahmen von Verkehrsunfällen und
Stürzen und gilt als die häufigste Todesursache junger Erwachsener in der
Altersgruppe zwischen 15 bis 20 Jahren.
Die Verletzungsformen werden je nach Länge und Tiefe der Bewusstlosigkeit in
leichte, mittelschwere und schwere Schädelhirnverletzungen eingeteilt.
Das leichte Schädel-Hirn-Trauma oder die Commotio cerebri ist verbunden mit
einer Funktionsstörung des Gehirns durch eine vorübergehende Fehlregulation
der Durchblutung, die in der Regel zu keinerlei morphologischen
Veränderungen oder neurologischen Ausfällen führt.
Bei der Contusio cerebri, der Gehirnprellung, kommt es hingegen immer zu
strukturellen Schäden in Form von Prellungsherden in Kortex, Marklager und
Hirnstamm, die Bewusstseinsstörungen, Herdsymptome mit Paresen,
Krampfanfälle und Hirnnervenausfälle zur Folge haben können.
Im Verlauf von schweren Gehirnverletzungen können Raum fordernde
Prozesse wie Hämatome und Ödeme zu einer Druckerhöhung, einer
Compressio cerebri führen, die als schwerste Form des Schädel-HirnTraumas gilt.
Die Prognose nach einer schweren Gehirnschädigung ist neben der primären,
mechanischen Verletzung, von sekundären, posttraumatisch auftretenden
zerebralen Veränderungen abhängig.
Ischämisch bedingte Sekundärschäden des Nervengewebes sind als
Ursachen anzusehen für eine meist lebenslang bestehende Behinderung der
Patienten.
Da die primären Hirnschädigungen meist irreversibel sind zielt man vor allem
durch so genannte neuroprotektive Therapien auf die Vermeidung sekundärer
Schäden ab.
Neuroprotektion umfasst im weitesten Sinne alle therapeutischen Verfahren,
welche die neuronalen Zellen nach der initialen Hirnverletzung vor weiteren
Schädigungen schützen. Es sind eine Reihe neurotropher oder neuroprotektiver
1 Einleitung
2
Proteine bekannt, deren Wirksamkeit experimentell nachgewiesen ist. Die
Substanzen wurden dabei dem Zentralen Nervensystem durch Injektion oder
Infusion direkt zugeführt.
Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Verwendung von mikroverkapselten,
gentechnisch modifizierten Stammzellen, die zerebral implantiert ein
neuroprotektives Protein, das Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), sezernierten.
Unter Mikroverkapselung versteht man die Einbettung von Zellen in eine auf
Hydrogelen basierende Alginatmatrix. Alginat besitzt als natürliches, aus
Braunalgen gewonnenes Substrat die Fähigkeit, eingebettete Zellen durch eine
semipermeable Membran vor dem Immunsystem des Wirt-Gewebes zu
schützen, eine Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und eine Freisetzung des
Wirkstoffes zu gewährleisten. Eine zerebrale Implantation ermöglicht die
Umgehung der Blut-Hirn-Schranke und eine hohe Wirkstoffkonzentration am
Applikationsort. Im Gegensatz zur in-vivo Gentherapie, bei der genetisches
Material in körpereigenen Zellen transferiert wird, gewährleistet die eingesetzte
ex-vivo Gentherapie einen sicheren Transfer von in Zellkultur gentechnisch
modifizierten verkapselten Zellen in den Wirt (TSENG u. AEBISCHER 2000).
Glucagon-like Peptide-1 als ein 3,3 kD großes Peptid, induziert eine Glukose
abhängige Insulinsekretion, beeinflusst die Neubildung von pankreatischen βInselzellen und ist an der zentralen Steuerung der Nahrungsaufnahme beteiligt
(TSENG et al.1999; DRUCKER 2001a, 2001b; STOFFERS et al.2000;
TURTON et al.1996). GLP-1 und der zugehörige Rezeptor wurden im Zentralen
Nervensystem nachgewiesen (MERCHENTHALER et al.1999; ALVAREZ et al.
1996). Kürzlich konnte tierexperimentell gezeigt werden, dass GLP-1
neuroprotektiv wirkt (PERRY et al.2003) und das assoziative und räumliche
Lernen verbessert (DURING et al.2003).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand eines etablierten,
experimentellen Schädel-Hirn-Trauma-Modelles (Controlled Cortical Impact) die
neuroprotektive
Wirksamkeit
des
GLP-1
bei
Ratten
untersucht.
2 Literaturübersicht
3
2.1 Schädel-Hirn-Trauma
2.1.1 Einführung
Bei dem Schädel-Hirn-Trauma handelt es sich um eine durch Gewalteinwirkung
verursachte Schädigung des Gehirns. Dabei kann es zu reversiblen oder
dauerhaften Funktionsstörungen als Folge der Einwirkung eines stumpfen oder
penetrierenden Traumas kommen.
Als Ursachen sind sowohl direkte, meist axonale, mechanische Schädigungen
des Nervengewebes (Impakttrauma), als auch indirekte Verletzungen durch
bewegungsbedingte Scherkräfte (Akzeleration-/Dezelerationstrauma)
zu
nennen. Weiterhin kann es indirekt durch die Erhöhung des intrakraniellen
Druckes durch Hämatome, Ödeme, Fremdkörper oder Infektionen zu einer
Beeinträchtigung des Gehirns kommen.
In Deutschland werden etwa zwischen 27.000 und 40.000 Fälle eines schweren
Traumas pro Jahr behandelt (NEUGEBAUER et al. 2000; LEHMANN u.
KRETTEK 2001). Schätzungen gehen von 200-300 Schädel-Hirn-Traumata
aller Schweregrade pro 100.000 Einwohner aus (PIEK u. JANTZEN 2000).
Anhand von Untersuchungen der Deutschen Gesellschaft für Neurologie
handelt es sich bei 80 Prozent der in eine Klinik überwiesenen Schädel-HirnTraumata um leichtgradige Verletzungen, während je 10 Prozent der Patienten
mittelschwere und schwere Schädigungen aufweisen.
Dabei wird zwischen einem leichten (Commotio cerebri) und mittelschweren bis
schweren (Contusio cerebri) Schädel-Hirn-Trauma unterschieden.
In der klinischen Klassifikation hat sich international die 1974 von TEASDALE u.
JENNETT eingeführte Glasgow-Coma-Scale (GCS) durchgesetzt. Sie dient
der initialen Bestimmung des Schweregrades des Schädel-Hirn-Traumas, der
Verlaufsbeurteilung und der Prognoseabschätzung mit Hilfe eines
Punktesystems zur Bewertung der funktionellen Beeinträchtigung der
Grundfunktionen Augenöffnen, verbaler und motorischer Reaktionen.
4
Basierend auf der Summeneinteilung repräsentiert ein GCS von 3-8 Punkten
ein schweres, von 9-12 ein moderates und von 13-15 Punkten ein leichtes
Schädel-Hirn-Trauma. Dabei werden die pathologischen und strukturellen
Ursachen der Hirnschädigung nicht berücksichtigt.
Das leichte Schädel-Hirn-Trauma 1. Grades oder die Commotio cerebri, die
auch als Gehirnerschütterung bezeichnet wird, ist gekennzeichnet durch eine
mechanisch induzierte, vorübergehende Hirnfunktionsstörung mit kurzzeitiger
Bewusstlosigkeit und in der Regel vollständiger Erholung und meist ohne
pathologisch-anatomisch fassbare Veränderungen.
Die Contusio cerebri oder Gehirnprellung entspricht einem Schädel-HirnTrauma 2. und 3. Grades. Sie ist mit einer langen Bewusstlosigkeit und
grundsätzlich mit morphologischen Hirnsubstanzschädigungen verbunden.
Diese
treten
als
Rindenprellungsherde
durch
das
so
genannte
Kontaktphänomen und auf der Gegenseite der Gewalteinwirkung (Contre-Coup)
in Erscheinung oder sind verursacht durch Scherkräfte, die axonale und
vaskuläre Veränderungen des Gehirngewebes hervorrufen können.
Auftretende Einblutungen und Hirnödeme können zu einer Erhöhung des
intrakraniellen Druckes und damit zu einer Compressio cerebri führen.
In den USA gehen Schätzungen davon aus, dass etwa bis zu 2 Millionen
Menschen jährlich ein Schädel-Hirn-Trauma erleiden, wobei 70.000 Menschen
sofort an den Folgen des initialen Traumas sterben (KOSSMANN et al.1997).
Etwa die Hälfte der Patienten leiden nach einem schweren Schädel-HirnTrauma unter erheblichen Langzeitbeschwerden in Form von Einschränkungen
der geistigen Leistungsfähigkeit, zentralen Paresen und weiteren motorischen
und verbalen Behinderungen (SCHWEIBERER 1996).
5
2.1.2 Pathophysiologische Grundlagen
Als Folge des Schädel-Hirn-Traumas spielen sowohl primäre als auch
sekundäre Vorgänge eine Rolle, die fokale oder diffuse Schäden verursachen.
Bei den primären Hirnschäden handelt es sich um unmittelbare, durch die
mechanische Einwirkung von äußerer Gewalt verursachte, strukturelle
Hirnschädigungen, die irreversibel und nicht therapierbar sind. Sie können die
Blutgefäße, Nervenzellen, Axone und Gliazellen betreffen.
Es entstehen durch Kontakteffekte fokale Gewebeverletzungen in Form von
Schädelfrakturen, Kontusionen, Lazerationen oder zerebralen Hämatomen.
Gleichzeitig können Beschleunigungseffekte auch diffuse, axonale und
vaskuläre Verletzungen durch die auftretenden Scherkräfte verursachen
(shearing injuries).
Bei den Sekundärverletzungen spielen sowohl intrakranielle Raum fordernde
Ereignisse als auch ischämisch bedingte metabolische Prozesse auf zellularmolekularer Ebene eine Rolle.
Als wesentliche Ursache der sekundären Veränderungen sind eine Ischämie
und Hypoxie (CHESNUT et al.1993; BOUMA et al.1991), ein blutungsbedingter
Vasospasmus, Infektionen und traumatisch bedingte Epilepsien zu nennen. Die
kritische Absenkung der Hirndurchblutung innerhalb der zerebralen Ischämie
führt zu einer mangelhaften Versorgung des Gehirns mit Substraten und zu
einer Akkumulation von metabolischen Abfallprodukten.
2.1.3 Mechanismen der Zellschädigungen
Die zellulären Mechanismen, die der posttraumatischen Ischämie zugrunde
liegen, sind auftretende Ionenverschiebungen.
Die Ischämie, die sekundär nach einem Schädel-Hirn-Trauma entstehen kann,
führt zu einer Depolarisation der Zellmembran und folgend zu einem Einstrom
von Wasser und damit zu einer Gliazellschwellung. Dieses intrazelluläre
Hirnödem ist mit einer Erhöhung des intrakraniellen Druckes und einer
Verminderung der Hirndurchblutung und einer Zellschädigung verbunden.
6
Als weitere Ursache der Ausbildung von Hirnödemen ist die vorübergehende
Störung der Blut-Hirn-Schranke anzusehen (vasogenes Hirnödem).
Der zentrale Mechanismus posttraumatischer Zellschädigungen umfasst drei
pathophysiologische Vorgänge. Zum einen die Erhöhung der extrazellulären
Glutamatkonzentration, den exzessiven Einstrom von Kalziumionen in die
Zelle und zum anderen die Bildung freier Sauerstoffradikale.
Infolge des Energiemangels kommt es zu einer gestörten Wiederaufnahme von
Glutamat in die Zelle. Gleichzeitig führt die neuronale Depolarisation zu einer
vermehrten Freisetzung des Stoffes. So entstehen hohe extrazelluläre
Konzentrationen von Glutamat, die neurotoxisch wirken. Man spricht in diesem
Zusammenhang von Exzitotoxizität (OLNEY 1969), die zu einer akuten
Schwellung der Neurone und folgend zu einem Zelluntergang führt.
Ebenfalls bewirkt der Glutamat induzierte, verstärkte Energieverbrauch einen
anaeroben Gehirnstoffwechsel und damit eine intrazelluläre Ansäuerung des
Gehirngewebes (PELLERIN u. MAGISTRETTI 1994).
Der massiv erhöhte Glutamatspiegel führt zur Daueraktivierung des NMDARezeptors mit einer permanenten Öffnung des Kalziumkanals und einem
ununterbrochenen Einstrom und Überschwemmung des intrazellulären
Kompartiments mit Kalziumionen.
Diese induzieren eine Aktivierung intrazellulärer Enzyme wie Phospholipasen,
Proteasen und Endonukleasen und führen damit verbunden zu einer
vermehrten Lipolyse, Proteolyse und DNA-Fragmentierung, die einen Zelltod
zur Folge haben können (FARBER 1990).
Dabei beeinflussen sich Kalzium und Glutamat gegenseitig. Die durch Kalzium
induzierte Störung der neuronalen Zellmembranen bewirkt eine vermehrte
präsynaptische Freisetzung des vesikulär gespeicherten Glutamats, welches
wiederum einen gesteigerten Kalziumeinstrom zur Folge hat. Durch den Abbau
der Membranphospholipide bildet sich Arachidonsäure und durch deren
Metabolisierung entstehen eine Fülle von biochemischen Folgeprodukten und
freie Sauerstoffradikale (LAFON-CAZAL et al.1993; SCHMIDLEY 1990).
Freie
Radikale
7
sind
hochreaktive,
toxische
Stoffe,
die
in
der
Reoxygenierungsphase nach einer Ischämie entstehen und zu einer
Peroxidation von Zellmembranphospholipiden und zur Oxidation von
Glykoproteinen und so zur Zerstörung von Neuronen, Glia- und Endothelzellen
führen können (ASANO et al. 1989; KONTOS u. POVLISHOCK 1986).
Einige Tage nach einem Trauma kann es erneut zur Öffnung der Blut-HirnSchranke
(BASKAYA
et
al.
1997)
und
zur
Einwanderung
von
Entzündungsmediatoren kommen (SOARES et al.1995). Entsprechende
Entzündunsvorgänge können ein zytotoxisches Hirnödem (KLATZO 1967) zur
Folge haben.
2.1.4 Klinisch-therapeutische Konsequenzen
Als Folge posttraumatischer, ischämisch-hypoxischer Veränderungen können
durch die Gewebsunterversorgung mit Sauerstoff, Hirninfarkte und Lähmungen
entstehen, auf zellulärer Ebene sind neuronale Degenerationen und
neuronaler Zelltod zu beobachten. Neben Schädigungen, die durch direkte
mechanische Verletzungen und lokale Verdrängung entstehen, sind die
Glutamat induzierte Exzitotoxizität, ein durch das Überangebot an
intrazellulärem Kalzium bedingte gesteigerte proteolytische Enzymaktivität und
inflammatorische Prozesse als Ursache für einen vermehrten Zelluntergang zu
sehen.
Hierbei sind sowohl nekrotische Veränderungen als auch apoptotische
Mechanismen für den Zelltod verantwortlich. Neben ischämischen Nekrosen
kann es unter Beteiligung immunologisch aktivierter Zellen zur Aktivierung von
Endonukleasen und damit zu einer DNA-Fragmentierung kommen.
Fokale Hirnkontusionen können durch Verletzungen der Blutgefäße zu
Hämatomen, bei Schäden der Blut-Hirn-Schranke zu Ödemen führen.
Infolge der Kontusion kommt es durch mitogene Faktoren zur Aktivierung der
Mikro- und Makroglia. Es ist dabei eine narbige Abgrenzung des
Kontusionsbereiches, eine deutliche reaktive Hyperplasie und Hypertrophie der
8
Astrozyten (CORTEZ et al.1989) und Aktivierung der Mikroglia (KOSTULAS et
al. 2002) zu beobachten.
Aufgrund einer ödematösen vasoparalytischen Erhöhung des zerebralen
Blutvolumens und durch traumatisch bedingte Störungen der Liquorzirkulation,
kann es zur Ausbildung eines posttraumatischen Hydrozephalus (PTH)
(MAZZINI et al. 2003; GUYOT u. MICHAEL 2000; MARMAROU et al. 1996)
und zu einer Gehirnschwellung kommen. Ein damit verbundener Anstieg des
intrakraniellen Druckes und Herabsetzung des zerebralen Stoffwechsels führt
zur Kompression und Atrophie des Gehirngewebes.
Bei diffusen axonalen Verletzungen sind durch Schädigungen des
Zytoskeletts ein Verlust der Mikrotubuli mit Unterbrechung des axonalen
Transports und eine reaktive axonale Schwellung mit Wallerscher Degeneration
zu beobachten (CASTEJON u. ARISMENDI 2003). Sie führen zu einer
Bewusstlosigkeit und Koma des Patienten. Die durch die Scherkräfte bedingten
diffusen Verletzungen treten dabei als Kleinstkontusionen und -blutungen
entlang der Kraftlinien am Übergang von grauer zu weißer Substanz auf.
9
2.2 Neuroprotektion
2.2.1 Einführung
Unter Neuroprotektion versteht man alle therapeutischen Interventionen mit
Hilfe schadensbegrenzender, hirnfunktionsschützender Maßnahmen zur
Protektion vulnerabler Neurone. Dabei geht es vor allem um die Vermeidung
sekundäre
Zellschäden
Krankheitsprogression
und
im
damit
Rahmen
um
die
Verzögerung
neurodegenerativer
der
und
neurotraumatologischer Erkrankungen. Die Zellen sollen vor akuten und
chronischen Schäden geschützt werden, die durch eine erhöhte Konzentration
freier
Radikale,
oxidativem
Stress,
durch
eine
Reduktion
des
Energiemetabolismus, durch eine gestörte Proteindegradation und durch das
Überwiegen des exzitotoxischen Glutamates entstehen.
2.2.2 Therapieansätze
Die Therapieansätze umfassen im weitesten Sinne die Verlängerung der vom
neuronalen Gewebe tolerierten Ischämiedauer unter Einschluss von Prävention
und Regeneration. Zur neuroprotektiven Behandlung wurde ein breites
Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen wie
anti-inflammatorische, anti-apoptotische, anti-oxidative oder a n t i exzitatorische Effekte untersucht (KOSSMANN et al. 1997).
Im Rahmen der klinischen Neurochirurgie werden zur neuroprotektiven
Behandlung zerebroprotektive Pharmaka wie beispielsweise Kortikosteroide
und Mannitol eingesetzt. Dabei üben die Kortikosteroide durch eine
Verminderung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke einen positiven Einfluss
auf die Hirnschwellung aus. Weiterhin hemmen sie den Abbau der
Membranphospholipide.
Mannitol kommt aufgrund des osmotischen Effektes zur Reduktion eines
Hirnödems und zur Senkung des intrakraniellen Druckes bei der Behandlung
10
des Schädel-Hirn-Traumas zum Einsatz. Es führt zur Volumenreduktion und zur
Verbesserung der zerebralen Durchblutung.
Bei einer zerebralen Ischämie tritt eine intrazelluläre Kalziumakkumulation auf,
die im Rahmen klinischer Studien mit dem Kalziumantagonisten Nimodipin bei
Patienten mit Subarachnoidalblutungen (SAB) behandelt wird. Es soll zu einer
Verminderung des Vasospasmus und zu einer Verbesserung des zerebralen
Blutflusses führen. Dabei ist ein wissenschaftlicher Beweis der Wirksamkeit
jedoch noch ausstehend.
Im Rahmen der medizinischen Forschung wurden der Einsatz von
Radikalfängern (ANDERSON et al.1985), Kalzium- (MOHAMED et al.1985) und
Glutamat-Antagonisten (DIXON et al. 2003), NMDA- und AMPA-Antagonisten
zur Hemmung der glutamatergen Transmission, Stickstoffmonoxid-Modulatoren
zur Hemmung der neurotoxischen Wirkung von Glutamat (CHERIAN et al.
2000; SINZ et al.1999), Dopamin-Agonisten (DIXON et al.1999a) und
Wachstumsfaktoren beschrieben.
Untersuchungen beinhalteten beispielsweise den Einsatz von Amantadin als
Dopamin-Agonist (DIXON et al.1999a) und Etomidat als Glutamat-Antagonist
(DIXON et al.2003) im Rahmen einer experimentellen Gehirnverletzung anhand
des Controlled Cortical Impact, das auch in der vorliegenden Arbeit zur
Erzeugung einer fokalen Kontusionsverletzung des Gehirns eingesetzt wurde.
Nach systemischer Verabreichung von Amantadin und Etomidat zeigte sich
eine gesteigerte Überlebensfähigkeit der hippokampalen Neurone und eine
verbesserte motorische und kognitive Leistung der Tiere, die mit Hilfe des
Beam Balance Tests, des Beam Walking Tests und des Morris Water Maze
Tests untersucht wurde. Diese Untersuchungsmethoden kamen in der gleichen
Weise in der vorliegenden Arbeit zum Einsatz.
Als Neurotrophine werden die Proteine bezeichnet, die regulativ an der
Differenzierung und der Überlebensfähigkeit sich entwickelnder Neurone im
Zentralen und Peripheren Nervensystem beteiligt sind.
11
Diverse Veröffentlichungen beschreiben das neurotrophe und neuroprotektive
Potential von Wachstumsfaktoren, beispielsweise der Fibroblast growth factor-2
(YOSHIMURA et al.2001, 2003; CHADI u. FUXE 1998), der Nerve growth factor
(SINSON et al.1996), der Insulin-like growth factor-1 (CARRO et al.2000, 2002)
und der Brain-derivated neurotrophic factor (HAMA et al.2001; GRIESBACH et
al.2004), die nach Induktion einer experimentellen Gehirnschädigung zu einer
Stimulation der Neurogenese führten.
2.3 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma
Zur Beurteilung der komplexen physiologischen, histopathologischen und
kognitiven Änderungen, die mit einer traumatischen Hirnverletzung
einhergehen, wurden eine Reihe von tierexperimentellen Modellen entwickelt.
Aufgrund der Heterogenität der Erkrankung ist der Einsatz nur eines Modells
zur Abdeckung des gesamten Spektrums des Schädel-Hirn-Traumas nicht
möglich.Die Voraussetzung für den Einsatz tierexperimenteller Modelle ist die
Kontrolle der für die benutzte Tierart relevanten Variabilitäten wie Alter,
genetischer Hintergrund und Physiologie (FINNIE u. BLUMBERGS 2002). Dies
wird durch standardisierte Zucht- und Haltungsbedingungen gewährleistet.
Weiterhin müssen die mechanischen Parameter und operativen Techniken,
unter anderem die Lokalisation und der Schweregrad der Verletzung klar
definiert sein, um eine Quantifizierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Versuche
zu ermöglichen.
Dies gilt auch für eine standardisierte Protokollierung und Untersuchung.
Die am häufigsten verwendete und am besten etablierten Nager-Modelle sind
das „Weight-Drop“ Modell, das „Fluid-Percussion“ Modell und das „Rigid
Indentation“ oder „Controlled Cortical Impact“ Modell.
Prinzipiell kann man die Modelle hinsichtlich der Art des induzierten Traumas
unterscheiden.
Zum einen kommen Modelle zum Einsatz, die ein Impakttrauma zur Folge
haben, dazu gehört das „Fluid Percussion“ (FP) Modell und das „Controlled
12
Cortical Impact“ (CCI) Modell, zum anderen werden Modelle verwendet, bei
denen durch Akzeleration Gehirnverletzungen erzeugt werden. Dabei sind
auch Kombinationen möglich, wie beispielsweise das „Weight-Drop“ Modell, bei
dem der Schädel durch ein aufprallendes Gewicht eine Beschleunigung erfährt.
Prinzip des „Fluid Percussion Brain Injury“ Modelles ist eine lokale,
impulsartige Injektion von physiologischer Kochsalzlösung nach Trepanation
der Schädeldecke in den epiduralen Raum. Als Folge der sich ausbreitenden
Druckwelle entsteht lokal eine Gehirnprellung mit fokalen Schäden, petechialen,
intraparenchymalen und subarachnoidalen Blutungen, deren Schweregrad
durch Veränderung der Injektionsparameter variiert werden kann.
Vorteilhaft ist bei diesem Modell die breite Varianz der erzeugten Kontusionen
und Reproduzierbarkeit der Verletzung. Die Impulsvariablen sind zwar gut
bestimmbar, aber andererseits ist die biomechanische Analyse anhand des
komplexen Wechselspiels zwischen der Energie der Flüssigkeit und den lokalen
Gewebe schwierig (LIGHTHALL et al. 1989).
Als ein Beispiel für ein geschlossenes Schädel-Hirn-Trauma ist das „WeightDrop Closed Head Injury“ Modell (MARMAROU et al. 1994) zu nennen, bei
dem ein frei fallendes Gewicht auf die uneröffnete Schädeldecke trifft.
Neben einer fokalen Kontusion und Einblutungen, treten hierbei auch diffuse
axonale Verletzungen auf, die durch die Beschleunigung des Kopfes als Folge
des Aufpralles entstehen. Somit ist das gesamte Spektrum eines Schädel-HirnTraumas über Variationsmöglichkeit der Höhe und Schwere des eingesetzten
Gewichtes möglich. Vorteilhaft ist die relativ schnell durchführbare
Operationstechnik ohne Trepanation des Schädeldaches, allerdings unter
schwer kontrollier- und reproduzierbaren Bedingungen.
Zur Erzeugung einer isolierten, fokalen kortikalen Kontusion, die als klinisch
relevante Einzelkomponente bei einem Schädel-Hirn-Trauma zu nennen ist,
kam bei der vorliegenden, experimentellen Untersuchung das „Controlled
Cortical Impact“ Modell zum Einsatz. Dies wird im folgenden Kapitel näher
erläutert.
13
2.4 Controlled Cortical Impact (CCI)
Zur Erzeugung eines Impakttraumas wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit
das „Controlled Cortical Impact“ Modell oder „Rigid Indentation Brain
Injury“ Modell verwendet.
Es handelt sich um ein etabliertes Kontusionsmodell bei Maus und Ratte
(LIGHTHALL 1988, LIGHTHALL et al.1989, LIGHTHALL et al.1990; DIXON et
al.1991). Die Erstbeschreibung erfolgte 1988 durch LIGHTHALL.
Prinzip des Modells ist die Übertragung von Energie auf einen in den
Stereotakten fixierten Schädel mit Hilfe eines so genannten „pneumatic
impactors“ auf die intakte Dura mater. Es ermöglicht eine Erzeugung des
gesamten Spektrums der fokalen Gehirnverletzungen. Technisch handelt es
sich um einen pneumatisch betriebenen Stempel, der kontrolliert in den
freipräparierten Kortex eingeschossen wird.
Nach einer durchgeführten Kraniotomie trifft ein mit Druckluft betriebener
Schusszylinder in einem definierten Winkel auf die freigelegte Dura mater. Der
Zylinder ist auf einem Mikromanipulator fixiert, der eine exakte Bestimmung des
Zentrums des Aufpralls und des Schusswinkels ermöglicht.
Es entsteht eine kortikale, unilaterale und reproduzierbare Kontusion.
Histologisch findet man eine klar abgegrenzte, fokale Verletzung
unterschiedlichen Schweregrades mit intraparenchymalen, petechialen
Hämorrhagien.
Im Versuch können sowohl die Schussgeschwindigkeit durch Veränderungen
des eingestellten Druckluftwertes, die Aufprallsdauer, der Schusswinkel als
auch die Eindringtiefe des auftreffenden Bolzens individuell eingestellt werden
(LIGHTHALL et al. 1989).
Vorteile dieses Modelles sind die Kontrollierbarkeit der Parameter und die
Vermeidung schwer steuerbarer diffuser Verletzungen, die im Rahmen anderer
tierexperimenteller Modelle bei einem unfixierten Kopf durch Beschleunigung
entstehen.
14
2.5 Glucagon-like Peptide-1
2.5.1 Einführung
Bereits 1964 wurde beobachtet, dass es nach oraler Gabe von Glukose zu
einer deutlich stärkeren Insulinfreisetzung kam, als nach intravenöser
Verabreichung (zitiert nach CREUTZFELDT 2005). Als Ursache wurde eine
Freisetzung intestinaler humoraler Substanzen vermutet, die diesen inkretinen
Effekt auslösen.
Neben den duodenalen Glucose-depent insulinotropic polypeptiden (GIP),
denen als erstes die Wirkung eines Inkretins nachgewiesen werden konnte
(DUPRE et al.1973), zeigten spätere Untersuchungen ein weiteres Inkretin, das
Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) (MOJSOV et al.1987; KREYMANN et al.
1987).
Dieses intestinale Hormon führt nach der Nahrungsaufnahme zu einer
Stimulation der Glukose abhängigen Insulinsekretion.
Die Klonierung und Sequenzierung des Präproglukagon-Gens und GlukagonPräkursors in verschiedenen Spezies ermöglichte die Aufklärung der
Biosynthese von Glukagon und der Glucagon-like Peptide.
BELL et al. (1983) konnte zwei Glukagon-ähnliche Substanzen finden und
nannte sie Glucagon-like Peptide-1 und -2.
HOLST et al. (1987) gelang die Isolierung von GLP-1 aus Schweinedünndarm
und eine teilweise Analyse der Aminosäure-Sequenz, die vollständig von
ORSKOV et al. (1989) bestimmt wurde.
GLP-1 entspricht Proglukagon 78-107, besteht aus 30 Aminosäuren (ORSKOV
u. NIELSEN 1988) und hat ein Molekulargewicht von 3,3 Kilodalton (ORSKOV
et al. 1989).
Die Zugehörigkeit der Glucagon-like Peptide-1 und -2 zu den Peptiden der
Glukagon-Familie erklärt sich durch die Sequenzhomologie der Aminosäuren zu
Glukagon (KIEFFER u. HABENER 1999).
Bei Säugern enkodiert ein Proglukagon-Gen neben weiteren Peptiden, zwei
Glucagon-like Peptide (GLP-1 und GLP-2), die in ihrer Aminosäure-Struktur bis
15
zu 50 Prozent Identität mit dem pankreatischen Glukagon aufweisen
(DRUCKER 2001a).
Bei Glukagon (MAYO et al. 2003) handelt es sich um ein einkettiges
Polypeptidhormon, das in den α-Zellen des pankreatischen Inselapparates
gebildet wird und dessen Hauptfunktionen als Insulinantagonist die Freisetzung
von Glukose aus der Leber und einer verstärkte Glykogenolyse,
Glukoneogenese und Lipolyse sind.
Die biologische Aktivität von Glukagon, GLP-1 und GLP-2 dient der Regulation
der Nahrungsaufnahme und der Energiehomöostase.
Die Prozessierung des Proglukagons in das Glucagon-like Peptide-1 erfolgt in
endokrinen L-Zellen des Darms, die aus pluripotenten Stammzellen der Krypten
stammen (POTTEN u. LOEFFLER 1990) und deren höchste Konzentrationen
im Ileum und Kolon gefunden wurden (EISSELE et al. 1992).
Im Darm wird GLP-1 aus Proglukagon gebildet, dabei dient dieser als
Hauptquelle des zirkulierenden GLP-1. Die Speicherung erfolgt in den ilealen
L-Zellen in der aktiven Form von GLP-1, während es sich bei 50 Prozent des
zirkulierenden, endogenen Peptids im Plasma allerdings um die inaktivierte, Nterminal gespaltene Form von GLP-1 handelt.
GLP-1 wird im Pankreas, Magen-Darm-Trakt (ORSKOV et al.1986) und auch
im Zentralen Nervensystem synthetisiert (LARSEN et al.1997a, 1997b; TANGChristensen et al. 1998).
In vivo besitzt das bioaktive Glucagon-like Peptide-1 in der Zirkulation eine nur
sehr kurze Halbwertszeit von etwa 1 bis 5 Minuten (DEACON et al.1998). Es
wird nach subkutaner und intravenöser Applikation zu 80 Prozent in die inaktive
Form des GLP-1 gespalten (KNUDSEN u. PRIDAL 1996).
Die Inaktivierung des GLP-1 über eine N-terminale Degradation erfolgt durch
ein endogenes Enzym, die Dipeptidyl-Peptidase-IV (DPP-IV) (MENTLEIN et
al. 1993; KIEFFER et al. 1995).
Dieses Enzym ist identisch mit dem T- Zelloberflächen Antigen CD 26. Es übt
drei Hauptfunktionen aus. Zum einen besitzt es eine Peptidase-Funktion, bei
der es regulatorisch auf spezielle inkretine Substrate wirkt, wie GIP oder GLP-1.
16
In-vitro- und in-vivo Studien zeigten die Umwandlung von aktivem GLP-1 durch
die DPP-IV in die inaktivierte, am GLP-1-Rezeptor antagonisierende Form des
GLP-1 (KIEFFER et al.1995).
Zum anderen besitzt CD 26 neben der Peptidase-Funktion auch eine AdenosinDesaminase-Bindungsfunktion und nimmt anhand dessen Einfluss auf die
Proliferation von Lymphozyten.
Weiterhin wirkt CD 26 über die Extrazelluläre-Matrix-Bindungs-Funktion auf die
Regulation der T-Zell-Aktivität und die Gewebe-Remodulierung ein.
2.5.2 Rezeptor
Der GLP-1-Rezeptor zählt zu der Gruppe der Guanin-Nukleotidbindender
Protein (G-Protein) gekoppelter Glukagon-Rezeptor-Familie und wurde mit Hilfe
einer permanenten Insulinoma-Zelllinie nachgewiesen (GOKE u. CONLON
1988). GLP-1 bindet dabei an einen spezifischen 7-Transmembran-Rezeptor.
Er ist unter anderem auf β-Zellen des Inselapparates des Pankreas (ORSKOV
et al.1991) zu finden, wo GLP-1 als enteroendokrines Peptid zu einer Glukoseabhängigen Freisetzung von Insulin und zu einer Inhibition der GlukagonAusschüttung führt (KREYMANN et al.1987).
Weitere Lokalisationsorte des Rezeptors sind Herz, Lunge, Niere, Leber,
Magen, Muskel- und Fettgewebe und das Zentrale Nervensystem (WEI u.
MOSJOV 1995; KANSE et al.1988; BULLOCK et al.1996).
Der Nachweis der Expression des GLP-1-Rezeptors im Gehirn erfolgte bei
Nagern (GOKE et al.1995) und beim Menschen (WEI u. MOJSOV 1995;
SATOH et al. 2000; SHUGHRUE et al.1996).
Untersuchungen über die Wirkungen des GLP-1 im Gehirn ließen anhand
Lokalisationsbestimmungen des GLP-1-Rezeptors, die Vermutungen zu, dass
aktive Formen des GLP-1 über einen parakrinen Mechanismus als
Neurotransmitter oder Neuromodulatoren fungieren (KANSE et al.1988;
SHIMIZU et al.1987; CALVO et al.1995). Dabei konnten Einflüsse des Peptids
auf die Nahrungsaufnahme beobachtet werden (NAVARRO et al.1996).
17
Bei Untersuchungen der Lokalisation des GLP-1-Rezeptors zeigten sich hohe
Bindungsaffinitäten im Hypothalamus und Thalamus (ALVAREZ et al.1996;
SHUGHRUE et al.1996).
Im Hypothalamus wurde der GLP-1-Rezeptor vor allem in den Nuclei
supraopticus, paraventrikularis und arcuatus nachgewiesen (SHUGHRUE et al.
1996). Außerdem gelang eine Rezeptorbestimmung im Hippokampus, in den
Ependymzellen des Plexus choroideus des dritten Ventrikels und im primären
olfaktorischen Kortex.
Immunhistochemische Untersuchungen bestätigten, dass eine intrazerebrale
Verabreichung von GLP-1, Neurone in diesen Gebieten und im Hirnstamm
aktivierte (LARSEN et al. 1997a, 1997b) und zu einer deutlich verminderten
Nahrungsaufnahme führte, die durch die Gabe des Antagonisten Exendin-9
blockiert werden konnte (TURTON et al. 1996).
TANG-CHRISTENSEN et al. (2001) zeigte schließlich, dass der Nucleus
arcuatus eine zentrale Rolle in der Vermittlung der der Reduizierung der
Nahrungsaufnahme spielt.
Bei Untersuchung der Rezeptorexpression nach Gehirnverletzungen konnte
eine vermehrte Expression des GLP-1-Rezeptors sowohl in neuronalen als
auch in glialen Zellen beobachtet werden (CHOWEN et al. 1999).
Der GLP-1-Rezeptor ist gekoppelt an ein Adenylatcyclase-System. Eine
schematische Darstellung der Mechanismen der Signaltransduktion ist in der
Abbildung 1 einzusehen. Eine Aktivierung des Rezeptors führt zur Stimulation
der Adenylatcylase und daraus folgend zu einer gesteigerten Konzentration von
zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP). Dies konnte durch Präparationen
von Membranen hypothalamischen Ursprungs (KANSE et al. 1988) und sich in
Kultur befindlicher Neurone des Hippokampus (PERRY et al. 2002a, 2002b)
gezeigt werden. Die gesteigerte Konzentration von cAMP bringt eine
Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) mit sich, bei der es durch
Veränderungen der Aktivität der Ionenkanäle zu einem erhöhten Einstrom von
Kalziumionen kommt. Dies führt zu einer gesteigerten Exozytose von Insulin
(GROMADA et al. 1998a, 1998b).
18
Abbildung 1
Schematische Darstellung der Signaltransduktion des GLP-1-Rezeptors
7-Transmembran-Rezeptor mit den Untereinheiten α/β/γ , Adenylatcyclase (AC),
Proteinkinase-A (PKA), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), Proteinkinase C (PKC),
pancreatic and duodenal homeobox gene-1 (PDX-1), Mitogen-activated Protein Kinase
(MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), Inhibitoren: PD 98059, LY 294002
aus: PERRY u. GREIG (2003)
2.5.3 Wirkungen
Haupteffekt des GLP-1 ist dessen Rolle als Inkretin am endokrinen Pankreas
über aktivierte GLP-1-Rezeptoren an der Zellmembran der β-Zellen, bei der die
Insulinfreisetzung durch die absorbierte Glukose ausgelöst und potenziert wird
(HOLST et al.1987; MOJSOV et al.1987; ORSKOV et al.1988).
Die Wirkung ist dabei gebunden an die Anwesenheit von Glukose und führt zur
gesteigerten Sekretionsleistung der β-Zellen (MONTROSE-RAFIZADEH et al.
1994) und zur Sensibilisierung der β-Zellen für Glukose (HOLZ et al. 1993).
Am Pankreas konnten drei Wirkungswege des GLP-1 beobachtet werden.
Dabei spielen im Pankreas und im Zentralen Nervensystem die gleichen
Signaltransduktionswege eine Rolle.
19
Zum einen wurde anhand von Untersuchungen durch den Einsatz von GLP-1
bei β-Zelllinien in-vitro (BUTEAU et al.2003) und von GLP-1-Rezeptoragonisten
in-vivo eine gesteigerte β-Zellproliferation beobachtet werden (PERFETTI u.
MERKEL 2000, PERFETTI et al.2000; XU et al.1999; EDVELL u. LINDSTROM
1999; STOFFERS et al.2000). Zum anderen konnten antiapoptotische
Wirkungen an den β-Zellen nach GLP-1-Gabe bei Ratten und Mäusen
nachgewiesen werden (FARILLA et al.2002; LI et al.2003).
In-vitro Versuche an β-Zelllinien, bei denen apoptotische Stimuli in Form von
Zytokinen oder Peroxiden zugesetzt wurden, waren ein deutlich verminderter
Zelltod zu beobachten (LI et al.2003; HUI et al.2003).
Weiterhin besitzt GLP-1 eine stimulierende Wirkung auf die Neogenese und die
Differenzierung der pankreatischen Inselzellen (ZHOU et al.1999; PERFETTI et
al.2000; XU et al.1999).
Weitere metabolische Effekte umfassen die Unterdrückung der Glukagonsekretion (RITZEL et al.1998; ORSKOV et al.1988) und die Regulation der
Nahrungsaufnahme (TURTON et al.1996).
Im Zentralen Nervensystem konnte die Expression des GLP-1-Rezeptors
(GOKE et al.1995; SHUGHRUE et al.1996) und eine Beteiligung an der
Futteraufnahme belegt werden. Es entstand die Vermutung, dass es sich bei
GLP-1 um einen endogenen Sättigungsfaktor handelt (TURTON et al.1996).
Sowohl TURTON et al. (1996), LARSEN et al. (2001), als auch MEERAN et al.
(1999) zeigten, dass eine zerebrale Verabreichung von GLP-1 mit einer
verminderten Futteraufnahme verbunden war. Diesen anorektischen Wirkungen
konnte eine zentrale Vermittlung zugesprochen werden (TURTON et al.1996),
da GLP-1 in den Nuclei des Hypothalamus gefunden wurde, welcher eine
entscheidende Rolle bei der Kontrolle des Essverhaltens spielt.
Weitere
GLP-1
induzierte
Effekte
sind
eine
Verminderung
der
Magensäuresekretion (WETTERGREN et al.1998) und eine reduzierte
Dünndarmmotorik (TOLESSA 1998). Außerdem wurden anabolische
Wirkungen an der Leber, dem Muskel- und Fettgewebe (VILLANUEVA-
20
PENACARILLO et al.1994; OBEN et al.1991) und Einflüsse auf das
kardiovaskuläre System mit einer Steigerung des arteriellen Blutdruckes und
der Herzleistung dargestellt (BARRAGAN et al. 1994,1999).
Eine Zusammenfassung der Effekte des GLP-1 liefert die Abbildung 2.
Abbildung 2
Übersicht über die Wirkungen des Glucagon-like Peptide-1
aus: KIEFFER u. HABENER (1999)
2.5.4 Therapeutischer Einsatz
Diverse Untersuchungen zeigten die regulatorische Wirkung des Glucagon-like
Peptide-1 innerhalb der Zellproliferation, der Differenzierung und im Rahmen
apoptotischer Vorgänge der pankreatischen β-Zellen (BRUBAKER u.
DRUCKER et al.2004; FARILLA et al. 2002, 2003). Außerdem wurde die
Wirksamkeit des GLP-1 im Gehirn nach Aufnahme des Proteins aus der
Blutbahn über den entsprechenden Rezeptor bewiesen (ORSKOV et al.1996).
Aktuelle Publikationen weisen auf ein mögliches neurotrophes
und
neuroprotektives Potential des GLP-1 hin (PERRY et al. 2002a, 2002b,
2002c, 2003; DURING et al. 2003).
Nach zerebraler Gabe von GLP-1 konnte eine Aktivierung endokriner Neurone
im Hypothalamus und Hirnstamm beobachtet werden (LARSEN et al. 1997b).
21
So konnten zytotrophe und antiapoptotische Wirkungen von GLP-1 sowohl am
Pankreas als auch in neuronalen Zelllinien gezeigt werden.
Dabei wurde festgestellt, dass sowohl in der Zellkultur (PERRY et al.2002a) als
auch nach zerebraler Injektion von GLP-1 (DURING et al.2003) über dessen
Rezeptor im Gehirn, apoptotische Stimuli modifiziert werden konnten.
Zum Nachweis der Induktion der neuronalen
Zellproliferation und
Differenzierung wurde eine in Kultur genommene Tumorzelllinie verwendet.
Nach Zugabe von GLP-1 und dessen Analogon Exendin-4 zeigten sich eine
verstärkte Differenzierung und ein gesteigertes Auswachsen der kultivierten
Neuriten, deren Ausmaß dem Neuritenwachstum nach der Zugabe des Nervegrowth-factors (NGF) ähnlich war (PERRY et al.2002a).
Weiterhin wurden Untersuchungen des protektiven Potentials des GLP-1 vor
exzitotoxischer neuronaler Schädigungen durchgeführt. Die beteiligten
Faktoren sind in der Abbildung 3 einzusehen.
Sowohl bei mit Glutamat behandelten kultivierten, hippokampalen
Rattenneuronen als auch im Rahmen eines etablierten neurodegenerativen
Nagermodelles durch die Infusion von Ibotensäure (PERRY et al.2002c, 2003),
zeigten GLP-1 und dessen Analogon einen Schutz vor einer Glutamat
induzierten Apoptose (GREIG et al.2004).
Die möglichen proliferativen und antiapoptotischen Wirkungen von GLP-1 im
Zentralen Nervensystem führten zum Einsatz von GLP-1 bei der Behandlung
von Alzheimer oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen (PERRY et
al.2002c, 2003). GLP-1-Antagonisten bewirkten eine Steigerung der Amyloid-βproteininduzierten Apoptose (OKA et al.2000), die bei der Alzheimererkrankung
eine entscheidende Rolle spielt.
Die antiapoptotische, G-Protein gekoppelte Signaltransduktion spielt auch bei
der Zellplastizität, bei Lernen und Gedächtnis eine wesentliche Rolle. Der
GLP-1-Rezeptor ist unter anderem im Hippokampus zu finden (ALVAREZ et
22
al.1996), durch GLP-1-Gabe stimulierbar und zeigte eine Steigerung des
Lernverhaltens (MATTSON et al.2003).
Bei Untersuchungen von GLP-1-Rezeptor defizienten Mäusen wurden im
Gegensatz zu gesunden Tieren eine deutliche Verminderung der Lernfähigkeit
und eine Verstärkung des neuronalen Zellunterganges nach Kainat-Injektion
beschrieben (DURING et al.2003).
Abbildung 3
Schematische Darstellung der Mechanismen des Zellschutzes
durch das Glucagon-like Peptide-1
Proteinkinase A (PKA),Ser/Thr Kinase Akt/PKB, Transkriptionsfaktors cAMP
response element-binding protein (CREB), Phospatidylinositol-3-kinase (PI3K),
Mitogen-activated-Proteinkinase (MAPK), extracellular signal-regulated kinase
(ERK), Inhibitoren: LY294002, PD98059, Rp-cAMP
aus: PERRY u. GREIG (2003)
23
2.6 Mikroverkapselung
2.6.1 Einführung
Die Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, hierbei
besonders bei neurotraumatologischen Veränderungen, beschränkt sich derzeit
aufgrund der Komplexität der Krankheitsbilder auf eine meist nur
symptomatische Therapie. Die systemische Verabreichung potentieller
therapeutisch nutzbarer Stoffe wird durch die Präsenz der Blut-Hirn-Schranke
erschwert. Die geringe passive Permeabilität und das hoch selektive
Transportsystem der Blut-Hirn-Schranke wirkt bei dem Einsatz therapeutischer
Moleküle zur Behandlung zerebraler Krankheiten stark limitierend (EMERICH u.
SALZBERG 2001).
Als Lösungsansätze wurden die direkte zerebrale Injektion bioaktiver Proteine
und der Einsatz von Implantationspumpen untersucht. Problematisch erwiesen
sich zum einen die Dosierung und Stabilität der eingesetzten Proteine, zum
anderen kam es zu infektiösen Gewebsreaktionen auf die sich dauerhaft im
Gewebe befindlicher Apparaturanteile der Implantationspumpen (TSENG u.
AEBISCHER 2000).
Bereits 1964 entstand durch CHANG die Idee einer durch polymere
Membranen immunisolierende Transplantation von Zellen. Im diesem
Zusammenhang bietet sich insbesondere die zerebrale Transplantation an, da
es sich bei dem Gehirn um ein immunologisch privilegiertes Organ mit einer
geringen Immunreaktion handelt.
In den letzten Jahren wurden zwei Verkapselungsansätze untersucht, zu einem
Makrokapseln wie zum Beispiel Hohlfaserkapseln und Diffusionskammern und
zum anderen Mikrokapseln. Unter Mikroverkapselung versteht man die
Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen, zum Beispiel Alginat, basierende
Matrix.
Die Implantation von makroverkapseltem Gewebe führte neben chirurgischen
Problemen, die auf die Größe der Kapseln zurückzuführen waren, zu einer
starken Abwehrreaktion beim Empfänger. Außerdem kam es, aufgrund der
24
langen Diffusionsstrecken in den Makrokapseln, zu einer Nekrose des
implantierten Gewebes und schließlich zu einem Versagen der Implantate
(KUHTREIBER et al.1999).
Im Gegensatz dazu bieten Mikrokapseln das Potential zur Lösung der bei den
Makrokapseln auftretenden Probleme. Zum einem haben sie durch ihren
kleineren Durchmesser ein besseres Oberflächen-Volumen-Verhältnis, zum
anderen erlauben sie ein definierte Bestimmung ihrer Permeabilität. Damit kann
die Diffusion von Metaboliten in die Implantate (zum Beispiel Sauerstoff oder
Glukose) und die Freisetzung der von den verkapselten Zellen produzierten
Stoffe ermöglicht werden. Gleichzeitig wird durch die immunisolierende
Alginathülle ein Eindringen der Immunglobuline ausgeschlossen. Weiterhin ist
durch die geringe Größe der Mikrokapseln, deren Durchmesser in der Regel
unter einem Millimeter liegt, die Möglichkeit der Transplantation mehrerer
Kapseln gewährleistet. Die Mikrokapseln können direkt injiziert oder mit minimal
invasiven chirurgischen Eingriffen in den Muskel, den Bauchraum oder in das
Zentrale Nervensystem transplantiert werden.
Diese auch als „Bioreaktoren“ bezeichneten Mikrokapseln können zur
Behandlung neurologischer Erkrankungen therapeutische Proteine freisetzen.
Das am häufigsten verwendete und derzeit bevorzugte Verkapselungsmaterial
ist Alginat (O’SHEA et al.1984). Bei der „Microencapsulated based cell and
tissue Therapy“ handelt es sich um eine neue Art der Transplantation, die sich
in den letzten Jahren entwickelt hat (LANZA et al.1996). Hierbei werden
Gewebe oder Zellen durch eine semipermeable Membran vor dem
Immunsystem des Empfängers geschützt und machen so eine dauerhafte
Behandlung ohne eine begleitende immunsuppressive Therapie möglich.
Neben verkapselten Gewebeanteilen, beispielsweise bei der Implantation
verkapselter pankreatischer Inselzellen zur Behandlung von Diabetes, wurden
bisher 3 Kategorien von Zellen (EMERICH u. SALZBERG 2001) eingesetzt.
Zum einen wurden postmitotische Zellen verwendet, wie adrenerge
chromaffine Zellen zur chronischen Schmerzbehandlung (BUCHSER et al.
25
1996), zum anderen kamen immortilisierte Zellen wie Dopamin sezernierende
PC12-Zellen zur Therapie der Parkinson Erkrankung zum Einsatz (AEBISCHER
et al.1991).
Ein weiterer innovativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch modifizierten
Zellen („cell engineering“).
Dieses Verfahren wird auch als ex-vivo Gentherapie bezeichnet, die im
Unterschied zur in-vivo Gentherapie, bei der genetisches Material direkt in
patienteneigene Zellen eingebracht wird, eine genetische Insertion in die Zellen
in vitro und eine folgende Implantation verkapselter, patientenfremder Zellen in
den Patienten beinhaltet.
Diverse Publikationen weisen auf einen möglichen Einsatz von Stammzellen bei
der Behandlung neurologischer Erkrankungen hin (TAI u. SVENDSEN 2004).
Im Rahmen der Verkapselungstechnik wurde der Einsatz von humanen
mesenchymalen Stammzellen beschrieben. Stammzellen sind am Anfang der
Entwicklung stehende Zellgruppen, die eine Fähigkeit zur Autoreproduktion
haben und nicht endgültig differenziert sind. Je nach Gewebezugehörigkeit,
beziehungsweise je nach Gewebe, das sie schließlich bilden, unterscheidet
man: embryonale (ES), germinale, hämatopoetische, somatische, epitheliale
und mesenchymale Stammzellen (MSC). Dabei werden sie nach ihren
Eigenschaften differenziert in pluripotente Zellen (beispielsweise embryonale
Stammzellen), in multipotenten Zellen (zum Beispiel mesenchymale
Stammzellen des Knochenmarks) und in unipotente Zellen (zum Beispiel
Zellen der Blutbildung).
Mesenchymale Stammzellen sind Zellen, die aus dem Mesenchym oder so
genannten embryonalem Bindegewebe stammen. Es stellt das multipotente
Muttergewebe von Binde- und Stützgewebe, glatter Muskulatur, sowie von
Skelett- und Herzmuskulatur dar. Bei den mesenchymalen Stammzellen
handelt es sich um adhärente, morphologisch den Fibroblasten ähnliche Zellen,
die aus dem adulten Knochenmark isoliert werden können.
26
2.6.2 Verkapselungsmaterial: Alginat
In den letzten zwei Jahrzehnten sind eine große Anzahl von Mikrokapseln aus
verschiedenen Materialien (Alginat, Agarose, Agar und synthetischen
Polymeren) entwickelt und getestet worden (DULIEU et al.1999).
Bei Alginat handelt es sich um ein anionisches Polysaccharid, das aus den
Bausteinen β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) besteht, die
über 1,4-Bindungen verknüpft sind. Einen schematischen Einblick der
Bestandteile gibt die Abbildung 4.
Alginat kann aus den Zellwänden von Braunalgen (Phaeophyceae) extrahiert
werden. Der Aufbau des Alginates wird durch 3 Sequenzblöcke bestimmt,
neben homopolymeren M-M- oder G-G-Blöcken liegen alternierende
heteropolymere M-G-Blöcke vor.
Es findet Anwendung in der Lebensmittelindustrie als Verdickungsmittel,
Stabilisator und Gelbildner.
Alginate besitzen die Fähigkeit, unter Zugabe von di- und polyvalenten
Kationen, mit Ausnahme von Magnesium (Mg2+), wässrige Gele zu bilden, die
zur Herstellung Poren enthaltender semipermeabler Mikrokapseln verwendet
werden können. Während monovalente Kationen zu keiner Gelbildung führen,
kommt es durch di- und multivalente Kationen wie beispielsweise Kalzium
(Ca2+) oder Barium (Ba2+) zu einer Quervernetzung innerhalb der G-Blöcke.
Es entsteht ein dreidimensionales Netzwerk, in dem die eingebetteten Zellen
eine Immobilisierung erfahren.
Im Rahmen der Verkapselungstechnologie wird bevorzugt Barium (Ba2+)
verwendet, das im Vergleich zu Kalzium (Ca2+) eine höhere Affinität zu Alginat
besitzt und zu einer stärkeren Gelbildung führt. Ein weiterer Nachteil des
Kalziums ist seine Chelatbildungsfähigkeit mit anderen körpereigenen
Molekülen wie beispielsweise Citrate. Im Rahmen von Untersuchungen fand
sich bei Alginatkapseln mit hohem Mannuronsäureanteil, die mit einer
Bariumchloridvernetzung hergestellt wurden, eine geringere fibrotische
27
Reaktion als bei Kalziumchlorid vernetzten Kapseln (DUVIVIER-KALI et al.
2001).
Durch eine Vertropfung der Alginatgele in divalente Kationen enthaltende
Alginatlösungen lassen sich Alginatperlen oder Alginatbeads mit Hilfe
spezieller Beadgeneratoren formen. Diese Mikrokapseln bestehen aus einer
inneren Alginathülle, in dem die entsprechenden Zellen in der polymeren
Alginatmatrix eingebettet sind und einer äußeren Alginathülle, die durch ihre
immunisolierenden Eigenschaften vor dem Immunsystem des Wirtes schützt.
Zusätzlich gibt diese Doppelverkapselung den Implantaten die nötige Stabilität.
Die Biokompatibilität oder Verträglichkeit der Alginatkapseln ist von der Größe
der Implantate, der Reinheit des Rohstoffes und insbesondere von der Struktur
des Alginates abhängig. Als Komplikation der Implantation von Alginatkapseln
ist ein fibrotisches Überwachsen der Kapseln zu nennen, das durch den
Sauerstoff- und Nährstoffentzug den Tod der verkapselten Zellen verursachen
kann.
Alginatkapseln mit einem hohen Mannuronsäureanteil führten innerhalb von
Untersuchungen zu einer verstärkten Stimulation des Immunsystem des Wirtes
mit einer vermehrten Bildung proinflammatorischer Zytokine, während
Guluronsäurereiche Alginate sich intraperitoneal (KULSENG et al.1999) und
innerhalb des Gehirns von Ratten (READ et al. 2001) als gut tolerierbar
erwiesen.
Weiterhin
zeigten
Alginatkapseln
mit
einem
hohen
Guluronsäureanteil die größte Porenbildung, die sowohl zu einer verbesserten
Versorgung der verkapselten Zellen als auch zu einer effizienteren Freisetzung
des sezernierten Proteins führte (READ et al. 1999).
28
COOH
O
O
COOH
OH
OH
A
OH
OH
B
Abbildung 4
Schematische Darstellung der Bestandteile des Alginates
A: β-D-Mannuronsäure
B: α-L-Guluronsäure
2.6.3 Therapeutischer Einsatz
Viele Krankheiten werden durch fehlerhafte oder abnormale metabolische und
sekretorische Zellfunktionen verursacht, wie zum Beispiel Diabetes mellitus und
Parkinson. Bisher wurden solche Krankheiten durch extrakorporale Gabe der
fehlenden Stoffe (Hormone, Enzyme) therapiert. Damit kann allerdings die
physiologische Feinregulierung innerhalb eines komplexen Metabolismus nicht
nachempfunden werden (KUHTREIBER et al.1999). Ein Beispiel hierfür ist der
Insulin abhängige Diabetes mellitus (IDDM). Solche Patienten müssen sich
regelmäßig Insulin spritzen, was allerdings nicht ausreicht, um einen
bedarfsadaptierten Blutzuckerspiegel zu gewährleisten.
Anstelle medikamentöser Behandlungen sollen nicht-autologe standardisierte
Zelllinien, allogene und xenogene Zellen oder Gewebe transplantiert werden.
Diese Zellen oder Gewebe können die benötigten Substanzen produzieren und
bedarfsadaptiert in den Organismus freisetzen.
29
Vorteile der Mikroverkapselung als Methode zur Implantation lebender,
patientenfremder Zellen umfassen die lokale Applikationsmöglichkeit der
Implantate unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke, eine kontinuierliche und
dauerhafte Wirkstofffreisetzung, den Einsatz von Proteinen mit kurzer
Halbwertszeit, eine gute Verträglichkeit durch den Patienten und einen
gentherapeutischen Ansatz ohne Eingriff in das Genom des Menschen.
Erste erfolgreiche Implantation mikroverkapselter, lebender Zellen wurden
bereits 1980 von LIM u. SUN durchgeführt, denen eine dauerhafte Behandlung
diabetischer Tiere mittels implantierter, xenogener Inselzellen gelang.
AEBISCHER et al. zeigte 1988 im Rahmen eines experimentellen
Parkinsonmodelles bei Ratten in einer Langzeitimplantation von neuronalem
verkapselten Gewebe, dass die Kapseln zu keinerlei Abstoßungsreaktion oder
nekrotischer Veränderung führten. Innerhalb klinischer Versuche wurde
bestätigt, dass Alginat für die Stabilität, Verträglichkeit und das Überleben der
verkapselten Zellen sorgt (LAHAM et al.1999; SOON-SHIONG et al.1994).
Zahlreiche technische Fortschritte dieser Immunisolierungsmethode haben es
unter anderem ermöglicht, eine erfolgreiche therapeutische Transplantation von
allogenem Parathyroidgewebe in Patienten mit Hypoparathyroidismus
durchzuführen (HASSE et al.1997).
Die Verkapselungstechnologie wird bisher bei der Behandlung einer ganzen
Reihe von Erkrankungen wie Hämophilien, Anämien, Zwergwuchs, Leber- und
Nierenversagen, Insuffizienzen der Hypophyse und des ZNS in präklinischen
Versuchen angewendet. In einigen Anwendungen wurden bereits
therapeutische Heilversuche durchgeführt, zum Beispiel bei Diabetes mellitus
(SOON-SHIONG et al.1994), amyotropher Lateralsklerose (ZURN et al.2000;
AEBISCHER et al.1996), chronischem Schmerz (BUCHSER et al.1996),
Hypoparathyreodismus (HASSE et al.1997), Pankreaskarzinom (LOHR et
al.2001), Morbus Huntington (BACHOUD-LEVI et al.2000) und bei der
Behandlung maligner Gehirntumore (READ et al.1999; BJERKVIG et al.2003;
VISTED u. LUND-JOHANSEN 2003).
30
Aktuelle Publikationen befassen sich auch mit einer neuroprotektiven
Therapie mittels verkapselter neurotropher Faktoren oder entsprechender
Zellen, die neuroprotektive Stoffe freisetzen.
YASUHARA et al. (2005) zeigte den erfolgreichen intrazerebralen Einsatz des
verkapselten neurotrophen Faktors Glial cell line-derivated neurotrophic factor
(GDNF) als Neuroprotektivum bei der Behandlung der Parkinsonerkrankung.
Auch im Zusammenhang mit Morbus Huntington und Schlaganfall konnten die
neuroprotektiven Effekte von GDNF bestätigt werden. Dies erfolgte mit Hilfe der
intrakraniellen Implantation verkapselter, fetaler, porziner choroidaler
Plexusanteile, die in hohem Maße neurotrophe Faktoren freisetzen
(BORLONGAN et al.2004a, 2004b).
CHIANG et al. (2005) konnte durch die Transplantation von fetalen
Nierenzellen, die sich durch eine hohe Expression des neurotrophen GDNF
auszeichneten, hirnschützende Effekte bei neuronalen Verletzungen belegen.
Weiterhin wurde der neuroprotektive Einsatz von transplantierten, humanen
Stammzellen beschrieben (HAGAN et al.2003), die neurotrophe Faktoren zur
Behandlung von Parkinson sezernieren konnten (AKERUD et al.2001).
Der Therapieansatz des Glucagon-like Peptide-1 als Neuroprotektivum wurde
in verschiedenen Veröffentlichungen untersucht. Dabei konnten protektive
Effekte sowohl in einer kultivierten Tumorzelllinie (PERRY et al.2002a) als auch
nach zerebraler Injektion (PERRY et al.2002b, 2002c; DURING et al.2003)
gezeigt werden.
Bisher liegen keine Publikationen vor, die eine Verabreichung von Glucagonlike Peptide-1 anhand GLP-1 sezernierender, verkapselter Stammzellen zur
neuroprotektiven Behandlung einer traumatologischen Gehirnverletzung
beschreiben.
31
2.7 Ziel der vorliegenden Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer ex-vivo Gentherapie mit
mikroverkapselten, gentechnisch modifizierten Zellen als therapeutischer
Ansatz für die Behandlung der sekundären Folgezustände nach einem
induzierten Schädel-Hirn-Trauma. Diese zerebral implantierten Bioreaktoren
bestanden aus alginatverkapselten, gentechnisch veränderten, humanen
mesenchymalen Stammzellen (CellBeads® CellMed AG), die Glucagon-like
Peptide-1 freisetzten. Dabei sollte tierexperimentell die neuroprotektive
Wirksamkeit des GLP-1 mit Hilfe sowohl histologischer, immunhistologischer als
auch motorischer und kognitiver Untersuchungen nachgewiesen werden.
Die Biokompatibilitätsuntersuchung diente der Untersuchung folgender
Fragestellungen:
1. Besteht nach xenogener Langzeitimplantation von 8 Wochen eine
Umgebungs- oder Abstoßungsreaktion auf die Implantate?
2. Zeigt sich im Rahmen der xenogenen Langzeitimplantation ein
Unterschied bei der Umgebungs- oder Abstoßungsreaktion zwischen
immundefizienten und immunkompetenten Tieren?
3. Weisen die Implantate nach xenogener Langzeitimplantation von 8
Wochen eine Stabilität der Alginatkapsel und eine Vitalität der
verkapselten Zellen auf?
Die Untersuchung der Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 bei einem
Schädel-Hirn-Trauma erfolgte
unter
Berücksichtigung
folgender
Fragestellungen:
1. Kommt es nach einer xenogenen Langzeitimplantation von 4 und 8
Wochen zu einer Wirkstofffreisetzung von GLP-1?
2. Besteht nach einer xenogenen Langzeitimplantation von 4 und 8
Wochen eine Wirksamkeit von GLP-1 auf die Folgezustände des
Schädel-Hirn-Traumas?
3 Material und Methoden
32
3.1 Tiere
3.1.1 Herkunft
Die Versuchstiere stammten aus dem Institut für Versuchstierkunde und
Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover und
wurden zur Versuchsdurchführung in die Tierhaltung des S1-Bereiches des
International Neuroscience Institute Hannover (INI GmbH) überführt.
Bei den Tieren zur Biokompatibilitätsuntersuchung handelte es sich um 12
RNU/Ztm-Ratten (rnu/rnu), bestehend aus 8 männlichen und 4 weiblichen
Tieren, die durch eine Thymusaplasie eine Immundefizienz aufwiesen und 12
männliche BD-IX/Ztm-Ratten, als ein immunkompetenter Rattenstamm.
Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Operationen zwischen 8 und 12 Wochen alt
und wogen zwischen 210 und 350 Gramm.
Für die Überprüfung der Wirksamkeit des GLP-1 bei einem Schädel-HirnTrauma wurden 39 männliche Sprague-Dawley-Ratten (SPRD/Ztm) eingestellt,
die zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung 5 bis 6 Monate alt waren und ein
Körpergewicht von 400 bis 500 Gramm hatten.
3.1.2 Haltung und Fütterung
Die Zucht der Tiere erfolgte im SPF-Bereich des Zentralen Tierlaboratoriums
der Medizinischen Hochschule Hannover, die finale Haltung im S1-Bereich des
Forschungslaboratoriums des International Neuroscience Institute Hannover.
Die Tiere wurden in Gruppengrößen von maximal drei Tieren in Makrolon®Käfigen Typ IV unter kontrollierten, standardisierten Umweltbedingungen
gehalten. Gefüttert wurde ad libitum ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin®
Alleinfuttermittel 1324, Altromin GmbH, Lage).
Dabei hatten die Tiere stets freien Zugang zu Trinkwasser über Makrolon®Flaschen.
33
Als Einstreu wurde Standardweichholzgranulat für Labortiere verwendet
(beddinge 3-4, Fa. Altromin GmbH, Lage). Die Raumtemperatur betrug 21 °C ±
2 °C, bei einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte
ausschließlich über Kunstlicht in einem konstanten Hell-Dunkelzyklus mit
entsprechender 12-stündiger Hellphase von 6.00 bis 18.00 Uhr MEZ.
Die Versuchstiere wurden einmal in der Woche in neue Käfige umgesetzt.
Frisches Trinkwasser und Futterpellets erhielten sie zweimal in der Woche.
Die Operationen erfolgten zur Adaption an die neue Umgebung nach einer
Eingewöhnungszeit von mindestens einer Woche.
Im Anschluss an die durchgeführten Operationen wurden die Tiere für eine
Dauer von mindestens 3 Tagen auf eine Einzelhaltung in Makrolon®-Käfigen
Typ III umgestellt.
Zutritt zum Tierstall hatten nur Experimentatoren unter Einhaltung eines
Trockenbarrieresystems, bestehend aus Mundschutz, Haube, Überschuhen,
Kittel und Handschuhen.
Die
Haltung
und
die
Versuchsabläufe
wurden
mit
Hilfe
eines
Versuchstierbuches schriftlich niedergelegt. Folgende Daten der Versuchstiere
und der Versuchsdurchführung wurden erfasst: Tierstamm, Geschlecht,
Geburtsdatum, Einstellungsdatum, Projekt, Aktenzeichen des genehmigten
Tierversuchsvorhabens, Narkoseart, Operationsverfahren und -datum,
Euthanasiemethode und -datum und Unterschriften des Leiters des
Versuchsvorhabens und des Experimentators.
Alle Untersuchungen wurden durch die verantwortliche Regierungsbehörde
Hannover unter dem Aktenzeichen 509.6-42502-04/814 am 3.8.2004,
Änderung am 21.12. 2004, genehmigt und fanden ausschließlich im S1-Bereich
des Forschungslaboratoriums des International Neuroscience Institute
Hannover statt.
34
3.1.3 Narkose und Analgesie
Für die Durchführung der Versuche kam eine Injektionsnarkose mittels
intraperitonealer Verabreichung einer Kombination aus Ketanest® (Wirkstoff:
Ketamin, 75 mg/kg KGW, Pfizer) und Domitor® (Wirkstoff: Medetomidin, 0,2
mg/kg KGW, Pfizer) zum Einsatz, die für eine Narkosedauer von etwa 30
Minuten ausreichend war.
Die Narkosetiefe wurde während des gesamten Eingriffes durch Überprüfung
der Reflexe, insbesondere des Zwischenzehenreflexes kontrolliert. Dabei sollte
der Tiefenschmerz im Bereich der Zehen nicht mehr auslösbar sein. Bei
Wiedereinsetzen eines Schmerzreflexes erfolgte eine Narkoseverlängerung mit
einer intraperitonealen Verabreichung von Ketanest® (20 mg/kg KGW).
Bis zum Aufwachen standen die Tiere unter Beobachtung, sie wurden während
der Narkose und in der Aufwachphase zum Schutz vor Hypothermie warm
gehalten.
Zur postoperativen Analgesie der Tiere wurde Novaminsulfon ratiopharm®
(Wirkstoff: Metamizol-Natrium 110 mg/kg KGW) über das Trinkwasser in einer
Dosierung von 8 Tropfen auf 500 ml Trinkwasser für eine Dauer von
mindestens 3 Tagen verabreicht. Weiterhin erfolgte nach den operativen
Eingriffen zweimal täglich eine Kontrolle des Allgemeinzustandes der Tiere.
3.2 Implantate: CellBeads®
3.2.1 Herkunft
Die alginatverkapselten Implantate (CellBeads®) wurden durch die Firma
CellMed AG (Alzenau, Deutschland) hergestellt.
Als Implantate kamen sowohl leere CellBeads®, die keine Stammzellen, aber
Goldpartikel enthielten als auch mesenchymale Stammzellen humanen
Ursprungs (hMSC) mit entsprechendem Gold-Anteil zum Einsatz.
Eine schematische und lichtmikroskopische Darstellung der Implantate ist in
den Abbildungen 5 und 6 einzusehen.
35
Der GLP-1-produzierende Zellklon, der in den Untersuchungen der Wirksamkeit
des GLP-1 Verwendung fand, wurde in der gentechnischen S1-Anlage der
Firma CellMed AG generiert und verkapselt. Durch den Hersteller wurde die
Vitalität der Chargen in vitro mit Hilfe eines Alamar Blue Monitoring über 60
Tage kontrolliert.
3.2.2 Verkapselungstechnik
Bei der humanen mesenchymalen Stammzelllinie handelte es sich um Zellen,
deren Genom gentechnisch über einen Gentransfer nach einer Elektroporation
modifiziert wurde. Zur Produktion der Glucagon-like Peptide-1 produzierenden
Stammzelllinie wurde die GLP-1 cDNA in ein bei der Firma CellMed AG
entwickeltes Plasmid kloniert. Die Transfektion des Plasmidvektors in die
Zelllinie erfolgte durch eine modifizierte Elektroporationsmethode, bei der die
DNA durch Anlegen eines elektrischen Feldes direkt in den Nukleus der
Zielzelle eingeschleust wurde. Das Verfahren beinhaltete zudem eine „sanfte“
Immortilisierung der Zellen, die mit einer stark limitierten Zellteilung verbunden
war. Die verwendeten Zellen waren maximal zu ein bis zwei Zellteilungen fähig.
Die Biosicherheit und Virusfreiheit wurde vom Hersteller getestet.
Die humanen Stammzellen (hMSC), die innerhalb der Untersuchung der
Biokompatibilität zum Einsatz kamen, wurden mit einer Zelldichte von 20
Millionen Zellen pro Milliliter Alginatlösung in einem 20 mM BariumchloridFällbad vertropft und enthielten im Zellcore einen 10%igen Gold-Alginat-Anteil.
Die Verwendung von Gold ermöglichte eine verbesserte Wiederfindung der
Implantate sowohl bei der Explantation als auch im Rahmen der histologischen
Auswertung. Der Zellcore hatte eine durchschnittliche Größe von 400 µm, der
Gesamtdurchmesser betrug im Mittel 690 µm.
Die Herstellung der CellBeads erfolgte mit Hilfe von 0,7 mm großen Düsen.
Die Implantate enthielten im Duchschnitt 670 Zellen pro CellBead mit einem
Verhältnis von innerem Zellcore zur äußeren Alginathülle von 1:2.
36
Mit Glucagon-like Peptide-1 transfizierte humane Stammzellen (hMSC) zur
Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 wurden mit einer Zelldichte von
30 Millionen Zellen pro Milliliter Alginatlösung entsprechend verkapselt.
Der innere Zellcore war im Durchmesser 366 µm groß und die Implantate
hatten eine Gesamtgröße von 478 µm.
Die mit Goldpartikeln verkapselten, leeren CellBeads wiesen eine
durchschnittliche Größe von 455 µm auf.
Die Implantate wurden in ein Zellkulturmedium aufgenommen, bei 37°C und
5%igem CO2-Anteil weiter kultiviert, nach einem Tag Kultivierungszeit in einem
Versandmedium verschickt und unmittelbar nach der Ankunft implantiert.
Alginatmatrix
Sauerstoff
Nährstoffe
Keine Immunantwort
Gentechnisch modifizierte
Zellen
Therapeutischer
Wirkstoff
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Implantate: CellBeads®
A
Abbildung 6
Lichtmikroskopische Darstellung
nativer CellBeads® unmittelbar vor der
Implantation bei 50 facher
Vergrößerung
Sichtbar sind die äußere Alginatkapsel
und der innere Core
B
A: Leere CellBeads® mit Goldanteil
Durchmesser innerer Core: 360 µm
Durchmesser gesamt: 455 µm
B: CellBeads® mit GLP-1 sezernierenden
Stammzellen
Durchmesser innerer Core: 366 µm
Gesamtdurchmesser: 478 µm
37
3.3 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen
3.3.1 Biokompatibilitätsuntersuchung
Zur Untersuchung der Immunabschirmung durch die äußere Alginathülle der
CellBeads®, einer möglichen Umgebungs- oder Abstoßungsreaktion und zur
Beurteilung der Vitalität der verkapselten Zellen nach einer xenogenen
Langzeitimplantation, wurden insgesamt 24 Tieren operiert.
Ziel der Versuche war die Untersuchung der Eignung der Verkapselungstechnik
und des Einsatzes humaner Stammzellen bei der Behandlung zerebraler
Erkrankungen.
Im Rahmen der Versuchsdurchführung wurden 2 Gruppen unterschieden.
In der Gruppe I wurden bei 6 immundefizienten (RNU/Ztm) und 6
immunkompetenten (BD IX/Ztm) Versuchstieren leere CellBeads® implantiert.
Bei der Gruppe II erfolgte bei weiteren 12 Tieren (6 RNU-Ratten und 6 BD IXRatten) eine Implantation von CellBeads® mit einer humanen Stammzelllinie
(hMSC). Eine Übersicht gibt die Tabelle 1.
Schwerpunkt bei der Untersuchung der Implantation leerer CellBeads® war die
Umgebungsreaktion auf die Alginatkapsel und damit die Überprüfung der
intrakraniellen Bioverträglichkeit des Alginates. Mit der Verwendung humaner
Stammzellen wurde der Einsatz von xenogenen Implantaten untersucht.
Die Untersuchung der möglichen Abstoßungsreaktion bei sowohl
immundefizienten als auch immunkompetenten Versuchstieren diente der
Klärung des geeigneten Rattenstammes bei der Untersuchung der Wirksamkeit
des GLP-1.
Die Auswertung erfolgte histologisch nach einer Implantationsdauer von 8
Wochen mittels Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbter Gefrierschnitte mit 20 µm
Schnittdicke. Bei 5 Tieren wurde eine direkte Explantation der CellBeads® mit
humaner Stammzelllinie aus dem Gehirn vorgenommen. Nach einer
morphologischen Beurteilung wurden die Explantate durch den Hersteller auf
ihre Vitalität untersucht.
38
Tabelle 1: Übersicht der experimentellen Versuchsgruppen
Art der Implantate, Stamm und Anzahl der Tiere, Untersuchungsparameter und
Dauer der Implantation
Implantate
ImmunImmunUntersuchungsDauer
defizienter
kompetenter
parameter
der
Rattenstamm Rattenstamm
Implantation
(RNU/Ztm)
(BD IX/Ztm)
Tieranzahl
Tieranzahl
Gruppe I
6 Tiere
6 Tiere
Immun8 Wochen
Leere
abschirmung der
Cellbeads®
Alginatkapseln,
Umgebungsreaktion
Gruppe II
6 Tiere
6 Tiere
Immun8 Wochen
Cellbeads®
abschirmung der
Alginatkapseln,
mit
Umgebungsxenogener
reaktion,
Zelllinie
Vitalität der
(hMSC)
Implantatzellen
3.3.1.1 Gruppe I: Implantation leerer CellBeads®
In der Gruppe I wurden bei jeweils 6 RNU- und 6 BD IX-Ratten Alginatkapseln
ohne Zellen zerebral implantiert. Dabei wurde die Bioverträglichkeit der
Implantate durch die Untersuchung auf eine mögliche Abstoßungsreaktion nach
einer Implantationsdauer von 8 Wochen überprüft.
3.3.1.2 Gruppe II: Implantation von CellBeads® mit xenogener Zelllinie
In der Gruppe II der Biokompatibilitätsuntersuchung kamen xenogene Zellen
humanen Ursprungs (hMSC) bei 6 RNU- und 6 BD IX-Ratten zum Einsatz.
Auch hierbei wurden die Umgebungsreaktionen am Implantationsort und damit
die sichere Immunabschirmung der humanen Stammzellen untersucht. Die
Explantation der CellBeads® bei 2 immundefizienten und 3 immunkompetenten
Tieren ermöglichte die Untersuchung der Morphologie und Vitalität der
implantierten Zellen nach einer Langzeitimplantation von 8 Wochen.
39
3.3.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma
Die Untersuchung der Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) bei
einem Schädel-Hirn-Trauma wurde an insgesamt 39 immunkompetenten
Sprague-Dawley-Ratten (SPRD/Ztm) durchgeführt. Es wurden hierzu 4
Versuchsgruppen unterschieden. Einen Überblick verschafft die Tabelle 2.
Neben 9 Kontrolltieren, bei denen keine Operationen vorgenommen wurden,
kamen 10 Tiere zur Etablierung des Trauma-Modelles zum Einsatz.
Zur Untersuchung der Folgen einer Implantation bei einem Schädel-HirnTrauma wurden bei 10 Tieren leere CellBeads® und zur Untersuchung der
Wirkung des GLP-1 bei weiteren 10 Tieren Implantate mit humanen, GLP-1
sezernierenden Stammzellen ventrikulär in das Gehirn verbracht.
Ziel der Untersuchung war die Beurteilung der Vitalität und Funktionsfähigkeit
der verkapselten Zellen nach einer Langzeitimplantation bei jeweils 5 Tieren
nach 4 und 8 Wochen und dabei insbesondere das Ausmaß der
Wirkstofffreisetzung des Glucagon-like Peptide-1. Weiterhin wurde die
Wirksamkeit des von den Implantaten sezernierten GLP-1 auf die
Folgeschäden nach einem induzierten Schädel-Hirn-Trauma untersucht. Die
Gehirnverletzung wurde mit Hilfe eines etablierten Rattenkontusionsmodelles,
dem „Controlled Cortical Impact“ (CCI), durchgeführt.
Die histologische und immunhistologische Auswertung erfolgte anhand
angefertigter Kryostatenserienschnitte von 20 µm Schnittdicke, welche zur
Übersicht und zum Nachweis der Implantate mit Hämatoxylin-Eosin (H.E.), mit
der Nissl-Methode und mit 4 Antikörpern (Glucagon-like Peptide-1, Microtubuleassociated Protein-1, Glial fibrillary acidic Protein und MHC Typ II
Oberflächenantigen) angefärbt wurden. Zur Bestimmung des freigesetzten
Proteins wurde Liquor von allen Versuchstieren nach Ende der Versuchsdauer
von 4 und 8 Wochen gewonnen. Dabei dienten die Ergebnisse der
unbehandelten Tiere als Kontrollwerte für die 10 mit GLP-1 behandelten Tiere.
Die Untersuchungen der motorischen Leistung erfolgten mit Hilfe des Beam
Balance Tests und des Beam Walking Tests am Tag 1 vor und an den Tagen 1
40
bis 5 nach den Operationen. Die posttraumatischen, kognitiven
Folgeerscheinungen des Kontusionstraumas wurden anhand des Water Maze
Tests an den Tagen 14 bis 21 nach den entsprechenden Eingriffen untersucht.
Tabelle 2: Übersicht der experimentellen Versuchsgruppen
Operationsverfahren, Stamm und Anzahl der Tiere, Untersuchungsparameter
und Dauer der Implantation
Operation
Gruppe I
Kontrolltiere
Rattenstamm
(SPRD/Ztm)
Tieranzahl
9 Tiere
Gruppe II
Kontusionstrauma
(CCI)
10 Tiere
Gruppe III
Kontusionstrauma
(CCI) und
Implantation leerer
Cellbeads®
Gruppe IV
Kontusionstrauma
(CCI) und
Implantation GLP-1
sezernierender
Cellbeads®
(hMSC)
10 Tiere
10 Tiere
Untersuchungsparameter
Dauer der
Implantation
Beam Balance Test
Beam Walking Test
Etablierung des
Traumamodelles
Morphologische Befunde
nach Trauma
Beam Balance Test
Beam Walking Test
nach Trauma
Beam Balance Test
Beam Walking Test
nach Trauma
Beam Balance Test
Beam Walking Test
GLP-1-Konzentration im
Liquor
keine
Implantation
keine
Implantation
4 und 8
Wochen
4 und 8
Wochen
3.3.2.1 Gruppe I: Kontrolltiere
Als Kontrolltiere der Gruppe I dienten 9 Versuchstiere, die keiner Operation in
Form eines Kontusionstraumas oder Implantation unterzogen wurden und
deren Versuchsergebnisse in der histologischen und immunhistologischen
Auswertung und im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen der
motorischen und kognitiven Leistung als Vergleichsdaten Verwendung fanden.
41
3.3.2.2 Gruppe II: Trauma (CCI)
In der Gruppe II wurde bei 10 Tieren mit Hilfe des „Controlled Cortical Impact“
ein mittelschweres Schädel-Hirn-Trauma induziert. Die histologischen und
immunhistologischen Befunde dienten der Darstellung der Folgeschäden des
Schädel-Hirn-Traumas und ermöglichten die Etablierung des eingesetzten
Trauma-Modelles. Desweiteren stellten sie eine Vergleichsgruppe zur
Bemessung des möglichen Behandlungserfolges mit GLP-1 im Rahmen der
histologischen,
immunhistologischen,
motorischen
und
kognitiven
Untersuchung dar.
3.3.2.3 Gruppe III: Trauma (CCI) und Implantation leerer CellBeads®
Bei den Tieren der Gruppe III erfolgte neben der Erzeugung eines
Kontusionstraumas eine ventrikuläre Implantation von leeren CellBeads®.
Hierbei sollten die Auswirkungen einer Implantation von Alginatkapseln ohne
Zellen im Rahmen eines experimentellen Schädel-Hirn-Traumas untersucht
werden. Dies erfolgte mit Hilfe histologischer, immunhistologischer, motorischer
und kognitiver Methoden, deren Ergebnisse im Vergleich zu den unbehandelten
Tieren der Gruppe II und den mit GLP-1 behandelten Tieren der Gruppe IV
betrachtet wurden.
3.3.2.4 Gruppe IV: Trauma (CCI) und Implantation GLP-1 CellBeads®
Die Gruppe IV umfasste 10 Tieren, bei denen neben der Induktion des SchädelHirn-Traumas, GLP-1 sezernierende CellBeads® ventrikulär implantiert wurden.
Dabei erfolgte die Auswertung in Bezug auf die Proteinfreisetzung der
Implantate in den Liquor und einer damit verbundenen histologischen und
immunhistologischen Wirksamkeitsuntersuchung des sezernierten Proteins auf
das Schädel-Hirn-Trauma. Dabei wurde außerdem der Einfluss des GLP-1 auf
das Lernverhalten und die motorischen Fähigkeiten der Tiere berücksichtigt.
42
3.4 Versuchsdurchführung
3.4.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation
Ziel der durchgeführten Operationen war zunächst die Entwicklung einer
reproduzierbaren, stereotaktischen, zerebralen Implantationsmethode der
CellBeads®. Dabei sollte eine Kontaktaufnahme mit dem liquorführenden
System durch Eröffnung der Ventrikel sichergestellt werden.
Eine
Überprüfung
der
für
die
erfolgreiche
Implantation
und
Verbindungsaufnahme mit dem Ventrikelsystem geeigneten Koordinaten
erfolgte durch die histologische Auswertung an H.E.-gefärbten Gefrierschnitten.
3.4.2 Behandlung der CellBeads® vor Implantation
Eine Stunde vor Beginn der Arbeiten wurde die Sterilbank (Telstar AH-100) in
Betrieb genommen. Kurz vor der Implantation erfolgte die Überführung der
CellBeads® aus dem Transportmedium in ein über einem 6er well-plate
befindlichen Nylon-Siebchen mit einer Maschenweite von 100 µm (BD Falcon,
Bioscience, USA). Zur Vermeidung einer möglichen Fremdkörperreaktion auf
die Inhaltsstoffe des Mediums (zum Beispiel fetales Kälberserum) wurden die
CellBeads® mit etwa 30 ml steriler PBS-Lösung (0,1 M, pH 7,2) gewaschen. Im
Anschluss wurde das Siebchen schräg in eine 6er well-plate überführt, welches
soviel PBS enthielt, dass die CellBeads® gerade mit Flüssigkeit bedeckt waren.
Nun wurden unter Sichtkontrolle (Mikroskop, Carl Zeiss NC 32, Varioskop)
mittels einer zuvor mit sterilem, destillierten Wasser gespülten 10
Mikroliterspritze (Hamilton, Schweiz) die CellBeads® mit etwa 10 µl PBS-Lösung
dem Siebchen entnommen.
Im Rahmen der Biokompatibilitätsuntersuchung wurden bei jedem Versuchstier
10 CellBeads® implantiert. Innerhalb der Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1
konnten aufgrund des geringeren Durchmessers der Implantate 20 CellBeads®
in das Gehirn jedes Tieres appliziert werden.
43
Als Kontrolle der Anzahl der entnommenen Implantate wurde der Inhalt der
Mikroliterspritze in ein 6er well-plate gegeben und erneut definiert aufgezogen.
Zur Vermeidung des Aufquellens der CellBeads® in der PBS-Lösung wurden sie
unmittelbar nach dem Aufziehen mit dem Siebchen in ein 6er well-plate mit
Medium zurückgestellt.
Im Anschluss an die Implantation erfolgte eine Kontrolle des Kanüleninhaltes, in
dem sie mit etwas sterilem destillierten Wasser durchgespült und der mögliche
Restinhalt unter dem Mikroskop begutachtet und protokolliert wurde. Somit war
eine definierte Aussage über die Anzahl der real implantierten CellBeads®
möglich.
3.4.3 Stereotaktische Implantationstechnik
Die Operationen erfolgten mittels eines stereotaktischen, mikrochirurgischen
Verfahrens mit zerebraler Implantation der CellBeads® unter Kontaktaufnahme
mit dem liquorführenden System und bei lichtmikroskopischer Sichtkontrolle
(Mikroskop NC 32 Zeiss).
Zur Vorbereitung der Operation wurden die Tiere gewogen, gekennzeichnet
und das Operationsfeld auf der Schädeloberseite wurde auf einer Fläche von
etwa 2 x 2 cm rasiert, gereinigt und desinfiziert.
Im Rahmen der Versuchsdurchführung wurden die Tiere mit einer
intraperitonealen Injektionsnarkose aus der Kombination von Ketanest® und
Domitor® anästhesiert.
Zum Schutz vor Austrocknung der Bulbi oculi wurde eine pflegende Salbe
(Bepanthen Roche®) auf das Auge gebracht.
Vor der Fixierung der Ratte in dem Stereotakten (SAS 4120, ASI Instruments)
wurde mit Hilfe der Kombination aus den seitlichen Ohrbalken und der vertikal
am beweglichen Arm des Stereotakten positionierten Operationsnadel
Interaural 0 (IA0) bestimmt, das anhand anatomischer Richttoleranzwerte eine
Überprüfung des Bregmas als Orientierungspunkt möglich machte.
44
Die vollständige Schmerzausschaltung wurde vor Beginn der Operation anhand
von peripheren Schmerzreizen sichergestellt.
Das Tier wurde mit den auf 6 mm eingestellten Ohrbalken und der
Schnauzenklemme (Incisor bar) des Stereotakten fixiert und die Schädeldecke
horizontal ausgerichtet.
Vor Beginn des Eingriffes erfolgte eine erneute Desinfektion des
Operationsfeldes.
Die benötigten Instrumente wurden 20 Sekunden lang in ein auf 150°C erhitztes
Schnell-Sterilisiergerät (FST Fine Science Tools) verbracht.
Zur Präparation des OP- Bereiches wurde eine sagittale Hautinzision auf einer
Länge von etwa 1 cm vorgenommen. Die Haut wurde mit 4 Bulldog-Klemmen
aus dem OP-Bereich ferngehalten. Daraufhin wurde das Periost mehrmals
geschlitzt und mit einem Raspatorium zur Seite geschoben. Die Knochennähte
wurden zur besseren Darstellung mit 30%-iger H2O2-Lösung gebleicht.
Im Anschluss erfolgte die Bestimmung und Protokollierung der Koordinaten des
Bregmas nach Orientierung an der Sutura interfrontalis und der Sutura
sagittalis. Eine Kontrolle der Werte wurde mittels einer Differenzbestimmung zu
Interaural 0 durchgeführt. Daraufhin wurde die Position der Bohrlochtrepanation
ausgehend von Bregma im Bereich 1 mm posterior und 2 mm rechts lateral der
Mittelllinie
bestimmt.
Einen
schematischen
Überblick
über
die
Implantationskoordinaten gibt die Abbildung 7.
Die Trepanation der Schädelkalotte wurde mit einem 2,1 mm-Bohrkopf unter
Schonung der Dura mater vorgenommen. Diese wurde anschließend durch
eine Kanüle vorsichtig geschlitzt, um eine Verlegung der Mikroliter-Kanüle bei
der folgenden Implantation zu vermeiden.
Unter mikroskopischer Sichtkontrolle wurde die mit CellBeads® befüllte und im
Stereotakten fixierte Mikroliterspritze mit einer stumpfen Mikroliterkanüle in das
Bohrloch gefahren und von der Knochenoberfläche aus 6 mm abgesenkt. Die
ventrale Koordinate ermöglichte eine Penetration des Ventrikels.
45
Dabei wurden in der Biokompatibilitätsuntersuchung 10 CellBeads®, innerhalb
der Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 20 CellBeads®, in jeweils 10 µl
PBS-Lösung in das Gehirn verbracht.
Die Abbildung 8 zeigt das stereotaktische Operationsverfahren.
Die Injektion der verkapselten Zellen erfolgte nach Hochziehen der Kanüle um 1
mm in einer Tiefe von 5 mm. Die Injektion wurde schnell und mit dem gesamten
Volumen auf einmal verabreicht. Nach etwa 10 Sekunden Wartezeit wurde die
Kanüle langsam, in etwa 30 Sekunden, aus dem Gehirn entnommen.
Anschließend erfolgte unter der Sterilbank eine lichtmikroskopische
Überprüfung der Kanüle auf mögliche Restinhalte und Protokollierung der
Ergebnisse.
Die Trepanationsstelle blieb unverschlossen und die Hautwunde wurde mit
etwa 3 Stichen in Form von Einzelheften mit nicht-resorbierbarem Nahtmaterial
(Ethilon 4/0) versorgt. Das Operationsprotokoll ist im Anhang aufgeführt.
2 mm lateral
5 mm
ventral
A
B
Abbildung 7
Bereich der Implantationskoordinaten
A: Schematische Darstellung des Rattengehirns von dorsal mit markierter
Implantationsstelle
B: Querschnitt durch das Rattengehirn im Bereich der Implantation.
aus: Paxinos u. Watson (1998): „The Rat Brain in Sterotaxic Coordinates“
Koordinaten: 1 mm posterior, 2 mm lateral und 5 mm ventral zu Bregma
46
1
2 1
A
B
Abbildung 8
Stereotaktische Implantationstechnik
A: Im Stereotakten mittels Ohrbalken und Incisor bar fixiertes Tier (BD IX/Ztm)
B: Dorsalansicht der Implantationstechnik der CellBeads® mit abgesenkter
Mikroliterkanüle, Bregma (mit Pfeil markiert), 1: Sutura interfrontalis, 2: Sutura
sagittalis
3.4.4 Controlled Cortical Impact (CCI)
Zur Erzeugung eines moderaten Schädel-Hirn-Traumas mit fokaler Kontusion
fand das so genannte „Controlled Cortical Impact“ (CCI) Verwendung. Eine
Darstellung der CCI-Einheit ist in der Abbildung 9 einzusehen.
Nach tiefer Narkotisierung der Tiere mittels einer intraperitonealen Injektion von
Ketanest® und Domitor® wurde das Operationsfeld rasiert und desinfiziert.
Im Anschluss erfolgte die Fixierung des Tieres im stereotaktischen Rahmen.
Nach einer Mittelinzision der Haut und Entfernung des Periostes, wurden die
Koordinaten des Bregmas bestimmt und 1 mm posterior und 2 mm lateral die
entsprechenden CellBeads® nach einer Vorbehandlung stereotaktisch in den
rechten Seitenventrikel implantiert.
Nach Abpräparation und lateraler Abspannung des rechten Temporalmuskels
und sorgfältiger Blutstillung wurde der Kraniotomiemittelpunkt 3 mm posterior
und 4 mm rechts lateral zu Bregma markiert.
Folgend wurde eine im Durchmesser 6 mm große, kreisrunde Kraniotomie mit
einem Diamantbohrer so angelegt, dass die Dura mater unverletzt blieb.
47
Nun wurde der auf einer stereotaktischen Halterung fixierte pneumatische
Schusszylinder (nach LIGHTHALL 1988) positioniert.
Über zwei getrennt ansteuerbare, pneumatische Ventile wurde mit Hilfe eines
eingestellten Druckes eine Stange mit einem an der Spitze angebrachten
„Impaktor“ nach unten geschossen, verblieb für eine definierte Zeit in dieser
Endposition und sprang danach zurück .
Die Ansteuerung und Geschwindigkeitsmessung erfolgte mit Hilfe eines
Laptops und der Software „Labview“. Die Einschlagsgeschwindigkeit wurde
laseroptisch anhand eines hinter dem Schusszylinder angebrachten
Abstandsmessungssystems (optoNCDT) ermittelt und unmittelbar nach dem
Schuss von der Software des Laptops angezeigt.
Die mittlere Einschlaggeschwindigkeit (impact velocity) lag bei 3 Metern pro
Sekunde (m/sec). Unmittelbar vor der Traumaapplikation wurde die
Geschwindigkeit des Schusszylinders nochmals mit Probeschüssen überprüft.
Der „Impaktor“ oder Schusszylinder mit einem 5 mm großen Durchmesser
wurde mittig über der Kraniotomiestelle positioniert, dabei betrug der seitliche
Neigungswinkel 22° zur Vertikalen. Als Parameter zur Erzeugung einer
moderaten Kontusion wurde die Eindringtiefe mit 2 mm ab dem höchsten Punkt
der Dura mater und die Verweildauer mit 150 ms festgelegt.
Die Hautwunde wurde mit etwa 4 Einzelheften aus nicht-resorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilon 4/0) versorgt, dabei blieben die Bohrlochtrepanation und
die Kraniotomie unverschlossen.
Nach erfolgter Operation wurden die Tiere einzeln für mindestens 3 Tage in
Makrolon®-Käfige Typ III verbracht, ihre Erholung wurde in den ersten Stunden
überwacht und sie wurden analgetisch über 3 Tage mit Novalgin® über das
Trinkwasser versorgt.
48
*
A
Abbildung 9
B
C
D
E
Aufbau der CCI-Einheit
A: Stereotaktische Halterung für die Versuchstiere
B: Schussapparat im ausgelösten Zustand, laseroptischer Abstandsmesser *
C: Einheit mit 2 pneumatischen Ventilen zur Ab- und Aufwärtsbewegung des
Schusszylinders
D: Netzteil und Messeinheit zur laseroptischen Abstandsmessung
E: Laptop zur Ansteuerung der Ventile und Errechnung der Impaktgeschwindigkeit
nicht dargestellt: Druckluftkompressor
3.4.5 Explantation der CellBeads® nach Langzeitimplantation
Im Rahmen der Biokompatibilitätsuntersuchung wurde bei 5 der insgesamt 12
Versuchstiere, die einer xenogenen Implantation unterzogen wurden, nach
einer Verweildauer von 8 Wochen eine Entnahme der CellBeads®
vorgenommen.
Zur Beurteilung der Implantate wurden bei 2 RNU-Ratten und 3 BD IX-Ratten
die CellBeads® postoperativ aus dem Gehirngewebe explantiert und auf ihre
strukturellen Veränderungen untersucht. Der Schwerpunkt der Untersuchung
49
lag dabei auf der Beurteilung der Stabilität der äußeren Alginatkapsel und der
Vitalität der verkapselten, humanen Stammzellen.
Nach Euthanasie der Tiere durch Inhalation in einer 7%igen CO2-Atmosphäre
über mindestens 5 Minuten und Dekapitation, wurde der abgesetzte Kopf im
Sterotakten fixiert. Im Anschluss erfolgte die Entfernung des Schädeldaches
ausgehend vom Foramen magnum mit einer Hohlmeißelzange. Zur deutlichen
Darstellung des Stichkanals wurden dünne horizontale Schnitte des Gehirns
schichtweise mit einem Skalpell abgetragen und der Stichkanal wurde mit
einem Raspatorium erweitert.
Die sich im Gehirn befindlichen CellBeads® konnten nun in ein mit Medium
gefülltes Röhrchen überführt und nach grober Abfiltration der Gewebereste in
einem 6er well-plate unter dem Mikroskop betrachtet werden. Die CellBeads®
konnten aufgrund der Goldpartikel innerhalb des Zellcores aufgefunden und
entnommen werden.
3.4.6 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads®
Die Untersuchung der Vitalität und Funktionsfähigkeit der Explantate erfolgte
durch die Firma Cellmed AG. Die entnommenen CellBeads® wurden direkt nach
der Explantation in einem Versandmedium verschickt und nach Ankunft bei
dem Hersteller in Kultur genommenen. Jeweils 1 CellBead® pro Tier wurde mit
dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green in Kombination mit Propidiumjodid
angefärbt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um einen sensitiven
Vitalitätstest mittels dualer Fluoreszenz. Es ermöglicht die Visualisierung von
durch apoptotische Vorgänge bedingten DNA-Fragmentierungen.
SYBR Green färbt die DNA lebender Zellen an und emittiert nach einer
Anregung durch Licht der Wellenlänge von 488 nm eine hellgrün
fluoreszierende Strahlung (518 nm). Ein Energietransfer zwischen SYBR und
Propidiumjodid führt zur Darstellung von Zellmembranschäden, indem
Propidiumjodid in die toten Zellen diffundieren kann und diese rot fluoreszierend
anfärbt.
50
3.4.7 Liquorpunktion
Nach einer tiefen Narkotisierung der Tiere mit Ketanest® und Domitor® (Pfizer)
durch eine intraperitoneale Injektion erfolgte eine Rasur, Reinigung und
Desinfektion der Haut im Bereich des Os occipitale und des oberen Drittels der
Halswirbelsäule.
Nach Verbringen des Tieres in Sternallage und stereotaktischer Fixierung des
Kopfes wurde eine Flexion des Kopfes rechtwinklig zur Achse der
Halswirbelsäule durchgeführt.
Im Anschluss wurde unter mikroskopischer Sichtkontrolle median durch einen
occipito-nuchalen, dorsalen Hautschnitt und Abpräparation der Muskulatur die
Membrana atlantooccipitalis mikrochirurgisch freigelegt.
Nun konnte eine sichere Punktion der Cisterna magna durchgeführt werden.
Nach Durchstechen der Dura mater mit einer rechtwinklig zur Haut geführten
sterilen Kanüle (Perfusionsbesteck mit Flügel, 21 GA, Becton Dickinson
Infusion Therapy Systems Inc. Utah, USA) konnte langsam mit minimalen Sog
durchschnittlich 100 µl Liquor gewonnen werden. Zur Untersuchung der GLP-1Konzentration wurde direkt nach Gewinnung der Liquorprobe zur Vermeidung
eines extravitalen Proteinabbaus 2 µl eines DPP-IV-Inhibitors (DPP-405,
Biotrend) zugeführt.
Nach
einer
Zentrifugation
wurde
der
Liquor
bis
zur
Proteinkonzentrationsbestimmung in einem Micro tube (1,5 ml safety cap,
Sarstedt) bei -80 °C gelagert.
Im Anschluss wurde eine transkardiale Perfusionsfixierung der Versuchstiere
durchgeführt.
51
3.4.8 Liquoruntersuchung
Die Bestimmung der GLP-1-Freisetzung im Liquor erfolgte durch die CellMed
AG mit Hilfe eines für GLP-1 spezifischen ELISA (GLP Active ELISA, EGLP35K, Biotrend).
Dabei erfolgte neben der Bestimmung der GLP-1-Konzentration im Liquor der
10 mit GLP-1 für 4 und 8 Wochen behandelten Tiere der Versuchsgruppe IV,
eine Kontrolluntersuchung der weiteren Versuchsgruppen. Bei jeweils 2 Tieren
der Versuchsgruppe II, bei denen ein fokales Kontusionstrauma, und weiteren 2
Tieren der Gruppe III, bei denen neben der Traumainduktion die Implantation
leerer CellBeads®
vorgenommen wurde, erfolgte eine exemplarische
Untersuchung des Liquors. Die Liquorproben der gesunden Kontrolltiere
dienten der Bestimmung der Wiederfindungsrate des GLP-1 im Liquor nach
Zugabe von 10 pM synthetischem GLP-1. Die Werte der Proteinkonzentration
ergaben sich aus der Berechnung des realen ELISA-Wertes unter
Berücksichtigung des eingesetzten Liquorvolumens.
3.4.9 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung
Zur Beurteilung der motorischen Fähigkeiten fanden der Beam Balance Test
und der Beam Walking Test Anwendung. Zur Analyse des Lernverhaltens der
Tiere wurde der Morris Water Maze Test eingesetzt.
Die Versuchsdurchführung erfolgte durch nur einen Experimentator unter
Einhaltung einer konstant ausgewählten Tageszeit.
Die Untersuchungsprotokolle sind im Anhang aufgeführt.
52
3.4.9.1 Beam Balance Test
Zur Untersuchung der vestibulomotorischen Fähigkeiten der Tiere vor und nach
den Eingriffen wurde der Beam Balance Test durchgeführt.
Aufbau
Bei diesem Test wurden die Tiere in einer Gruppengröße von jeweils 5 Tieren
untersucht. Innerhalb eines Zeitrahmens von 60 Sekunden mussten sich die
Tiere auf einem Holzbalken von 2 cm Breite und 25 cm Länge, der sich 30 cm
oberhalb der Tischoberfläche befand, balancieren. Dabei wurde die
Aufenthaltsdauer auf der Apparatur in Sekunden festgehalten und in einem
Untersuchungsprotokoll vermerkt.
Um ein Verlassen der Apparatur zu vermeiden wurde an beiden Enden des
Holzbalkens jeweils eine etwa 20 cm große Plexiglasscheibe angebracht.
Unterhalb der Apparatur befand sich ein 6 cm dickes Schaumgummipolster, das
Verletzungen bei Stürzen verhinderte.
Ausführung
Die Testdurchführung wurde 1 Tag vor den Operationen gestartet, dabei galten
3 Versuche mit jeweils 60 Sekunden Dauer pro Tier als Basiswerte für die
folgenden Versuchsblöcke.
Die weiteren Untersuchungen fanden an den Tagen 1 bis 5 nach den
Operationen statt, mit jeweils 3 Durchgängen pro Tier und Tag. Ein Durchgang
dauerte maximal 60 Sekunden, zwischen den Durchgängen lag eine
Erholungszeit für die Tiere von jeweils 30 Sekunden.
Auswertung
Die Auswertung wurde anhand der gemessenen Verweilzeiten durchgeführt.
Als Grundlage galt die Aufenthaltszeit des Tieres auf dem Balken über maximal
60 Sekunden.
53
Die Zeiten der 3 Durchgänge pro Tag wurden addiert, ein arithmetischer
Mittelwert bestimmt und protokolliert. Anhand der Einzelmittelwerte wurden
Gruppenmittelwerte berechnet.
3.4.9.2 Beam Walking Test
Bei dem Beam Walking Test handelte es sich um ein so genanntes „negatives
reinforcement", bei dem nicht nur die Balancefähigkeiten im Stand beurteilt,
sondern außerdem die Überquerung eines Balkens im Lauf untersucht wurde.
Aufbau
Der aus Holz bestehende, 2,5 cm breite und 1 m lange Balken wurde auf
Holzgestell 1 m über dem Boden befestigt.
An einer Seite der Apparatur im Bereich des Startpunktes befand sich als
Motivationsverstärkung zur Überquerung des Balkens eine Lichtquelle (100
Watt) und ein Radio zur Erzeugung eines weißen Rauschens. Damit konnte
eine Aversionsumgebung geschaffen werden.
Auf der gegenüberliegenden Seite befand sich eine abgedunkelte Zielbox, in
der sich die Tiere für eine maximale Dauer von 30 Sekunden aufhalten konnten.
Nach dem Eintritt in die Zielbox wurden das Licht und das Rauschen
ausgeschaltet. Unterhalb der Versuchsapparatur befanden sich zum Schutz der
Tiere 10 cm starke Schaumgummiauflagen.
Ausführung
Die Durchführung erfolgte zeitgleich zum Beam Balance Test, 1 Tag vor der
Operation und in den ersten 5 Tagen nach den Eingriffen mit jeweils 3 täglichen
Versuchsdurchgängen für jedes Versuchstier.
Auswertung
Zur Beurteilung der motorischen Leistung wurden die Latenzzeiten bis zum
Erreichen der verdunkelten Zielbox gemessen. Dabei wurden die Werte für je
einen Versuchsblock aus 3 Durchgängen addiert, gemittelt und protokolliert.
54
3.4.9.3 Morris Water Maze Test
Zur Beurteilung kognitiver Defizite als Folge des Schädel-Hirn-Traumas wurde
der Morris Water Maze Test durchgeführt. Dabei handelte es sich um ein
etabliertes Verfahren zur Beurteilung des Lernverhaltens und des
Gedächtnisses. Dabei wird die Zeit gemessen, welche die in einem Becken
schwimmende Ratte benötigt, um eine Plattform zu erreichen („water escape
test“).
Aufbau
Bei dem verwendeten Versuchsaufbau handelte es sich um ein im
Durchmesser 150 cm breites und 42 cm hohes Plastikwasserbecken, das 28
cm mit 20°C warmem Leitungswasser befüllt wurde.
Eine kreisförmige, aus Plexiglas bestehende und 11 cm im Durchmesser große
Plattform diente als Zielobjekt. Sie befand sich in dem Wasserbecken innerhalb
eines definierten Quadranten. In der Abbildung 10 ist der Aufbau der
Testapparatur schematisch dargestellt.
Innerhalb der Trainingsversuche mit randomisierten Startpunkten sollte
untersucht werden, wie schnell die Tiere die Position der versteckten Plattform
lernen. Als Messparameter galt die Latenzzeit, die das Tier benötigte, um die
Plattform zu erreichen.
Im Rahmen der Versuchsdurchführung befand sich die versteckte Plattform
etwa 2 cm unterhalb der Wasseroberfläche in der Mitte eines konstant
ausgewählten Quadranten. Um zu garantieren, dass die Plattform nicht sichtbar
war, wurde das Wasser mit 1 Liter haltbarer Vollmilch eingetrübt. Das Wasser
wurde alle 2 Tage gewechselt.
Ausführung
Zu Beginn des Versuches wurden die Tiere in der Habituationsphase 1 Tag
vor dem Start der eigentlichen Untersuchungen zur Beurteilung der allgemeinen
Schwimmfähigkeit ohne Plattform in das Becken gesetzt. Dabei konnten
55
Präferenzen für einen der 4 Quadranten ausgemacht werden, in den später die
Plattform entsprechend nicht positioniert wurde.
Die eigentliche Testausführung fand in den Tagen 14 bis 21 nach den
Operationen statt. Dabei wurden täglich 4 Durchgänge pro Tier durchgeführt.
Im Rahmen der Versuchsgestaltung wurden unspezifische Reize aus der
Umgebung entfernt und 4 konstant eingesetzte Symbole in der Nähe des
Beckens angebracht.
Das zu testende Tier wurde mit dem Kopf in Richtung des Beckenrandes an
einem, innerhalb der 4 täglichen Durchgänge randomisierten Startpunkten
Nord(N), Ost (O), Süd (S) und , West (W) in das Wasser gesetzt.
Die maximale Schwimmzeit betrug 120 Sekunden. Konnten die Tiere innerhalb
dieses Zeitrahmens das Zielobjekt nicht erreichen, wurden sie für 30 Sekunden
auf die Plattform verbracht. Es wurden jeweils 5 Tiere in einer Gruppe getestet.
Zwischen den Durchgängen befanden sich die Tiere für jeweils 4 Minuten in
einem trockenen und mit einer Wärmequelle versehenen Käfig.
An den Tagen 14 bis 18 (Hidden Platform Version) wurde das räumliche
Lernen im Rahmen einer Aquisitionsphase untersucht, in der die Tiere die
Position der unterhalb der Wasseroberfläche befindlichen Plattform lernen
mussten. Die Plattform befand sich dabei stets in der Mitte desselben
Quadranten.
Zur Untersuchung des räumlichen Gedächtnisses wurde am Tag 19 eine
Spatial Probe durchgeführt, bei der die Plattform aus dem Becken entfernt
wurde. Dabei wurde die Aufenthaltsdauer innerhalb des Quadranten gemessen,
in dem zuvor die Plattform positioniert war.
Um nicht-spezifische Dysfunktionen außerhalb der Traumasymptomatik
auszuschließen, erfolgten an den Tagen 20 bis 21 Versuche mit einer
sichtbaren Plattform (Visible Platform Version). Hierzu wurden die
Hinweisreize aus der Umgebung entfernt und nur die Plattform gekennzeichnet.
56
Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit Aufzeichnung der Durchgänge mit Hilfe einer
digitalen Videokamera (Sony DCR-PC 100E), die zentral oberhalb des
Wasserbeckens positioniert und fixiert war und die mit Hilfe einer
Fernsteuerung bedient wurde. Die Auswertung erfolgte nach den
durchgeführten Versuchen an einem Fernsehbildschirm. Dabei wurde die
Latenzzeit vom Einsetzen der Tiere in das Wasserbecken bis zum Erreichen
der Zielplattform gemessen, die Suchzeit pro Einzeldurchgang und die Summe
der Latenzzeiten pro Versuchstag addiert, gemittelt und protokolliert. Konnte
das Tier die Plattform nicht innerhalb des definierten Zeitrahmens erreichen,
wurde die maximale Schwimmzeit von 120 Sekunden als Durchgangswert
festgelegt.
Zum Vergleich der Lernprozesse wurden jeweils die 4 täglichen Durchgänge
addiert und mit den unterschiedlichen Versuchstagen verglichen. Dabei konnte
zum einen die individuelle Lernentwicklung der Tiere dargestellt werden, zum
anderen waren Vergleiche zwischen den Versuchsgruppen möglich.
Innerhalb des Wasserbeckens:
N
1
Quadranten 1 bis 4
Start der 4 Durchgänge pro Tag
2
W
O
3
4
von randomisierten Startpunkten:
Nord (N), Ost (O), Süd (S), West (W)
Konstante Positionierung der
S
Zielplattform in Quadrant 4 (OS)
Abbildung 10
Schematische Darstellung des Morris Water Maze Test
57
3.5 Neuropathologische Untersuchungen
3.5.1 Transkardiale Perfusion
Am Ende der Versuchszeiträume wurde eine transkardiale Perfusion der Tiere
durch einen 0,01 M Phosphatpuffer (PBS) mit 4%igem frisch depolymerisierten
Paraformaldehyd (PFA, Sigma) durchgeführt.
Nach intraperitonealer Injektion einer Kombination aus Ketanest® und Domitor®
wurden die tiefnarkotisierten Tiere in Rückenlage auf einer Korkunterlage fixiert.
Dabei wurde auf eine stabile Kreislaufsituation geachtet.
Nach Durchführung einer Laparotomie folgte eine Eröffnung des Thorax.
Im Anschluss wurde der Herzbeutel vorsichtig aufgetrennt und das Herz
freigelegt. Die folgende Punktion des Herzens wurde mit Hilfe einer
Knopfkanüle durchgeführt, die von der Herzspitze über den linken Ventrikel bis
etwa 1 cm tief in die aufsteigende Aorta hineingeschoben und mit einer
Moskitoklemme in ihrer Lage fixiert wurde. Das Abklemmen der Aorta
descendens ermöglichte eine isolierte Durchströmung der oberen Körperhälfte.
Das rechte Herzohr wurde mit einem Scherenschlag eröffnet, um ein Ablaufen
des Blutes und der zirkulierenden Flüssigkeiten zu ermöglichen.
Der Perfusionsdruck entsprach etwa dem des Blutdruckes der Tiere und wurde
über die Höheneinstellung der angeschlossenen Infusionsflaschen reguliert.
Vor Einleitung des Fixiermittels wurde isotonische Kochsalzlösung infundiert,
bis der austretenden Flüssigkeit keinerlei Blut mehr beigemengt war, um einer
Koagulation des Blutes in den Gehirngefäßen und störenden Effekten der
Erythrozyten bei nachfolgenden Färbungen vorzubeugen.
Danach
erfolgte
die
fixierende
Infusion
mit
einer
4%igen
Paraformaldehydlösung (PFA) in der Menge von etwa 1 ml Lösung pro Gramm
Körpergewicht.
Im Anschluss wurde der Kopf abgesetzt und mittels einer Hohlmeißelzange die
Schädeldecke von kaudal her in kleinen Teilen abgetragen, bis das gesamte
Gehirn von dorsal her betrachtet werden konnte. Mittels eines Raspatoriums
58
wurden die austretenden Kopfnerven durchtrennt, das Gehirn in toto vorsichtig
entnommen und unmittelbar in ein mit 4% PFA befülltes Glasgefäß überführt.
3.5.2 Fixierung
Die entnommenen Gehirne wurden zwei Tage lang in 4%iger PFA-Lösung
nachfixiert. Nach zweimaligem Auswaschen der überschüssigen Fixans in PBSPuffer, erfolgte eine Äquilibirierung in einer 30%igen konzentrierten
Sucroselösung (Sigma, USA) bis zum Absinken der Gehirne. Dabei diente die
eingesetzte Sucroselösung als Kryoprotektion zur Vermeidung der Bildung von
Eiskristallen bei der folgenden Schockgefrierung der Gehirne.
3.5.3 Kryobehandlung
Die nach der transkardialen Perfusion entnommenen und in 4%igem
Paraformaldehyd nachfixierten Gehirne wurden in einer gefalteten
Aluminiumfolie mit durch Flüssigstickstoff gekühltem Intermedium (2Methylbutan, Roth) für maximal 5 Minuten schockgefroren und bei -20°C
aufbewahrt.
3.5.4 Gefrierschnitte
Nach Fixierung des Gehirns wurden die schockgefrorenen Präparate auf den
Objekttisch des Kryostaten mit Hilfe eines Einbettungsmittels für Gefrierschnitte
(Tissue Tek®, O.C.T™ Compound) aufgefroren und gleichzeitig eingebettet. Es
wurden Im Anschluss 20 µm dünne Coronalschnitte mit einem Gefriermikrotom
(Microm HM 560) angefertigt, mit einem Pinsel vom Messer abgehoben und
alternierend auf Super Frost® Objektträger (Menzel-Gläser) aufgenommen.
Die Objektträger wurden nach einer Trocknungszeit von mindestens 2 Stunden
bei -20 °C gelagert.
59
Im Rahmen der Biokompatibilitätsuntersuchung wurden insgesamt 10
Objektträger pro Versuchstier mit jeweils 6 Gewebeschnitten unter
Protokollierung der aufgenommen und verworfenen Gewebeschnitte erstellt.
Der Bereich der Auswertung der Gehirne lag zwischen 0,5 mm bis etwa 3 mm
posterior zu Bregma.
Als Schwerpunkt der durchgeführten Gefrierschneidetechnik galt die
Untersuchung des Ventrikelsystems zur histologischen Nachweisführung der
Implantate.
Innerhalb der Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 wurden die
Bereiche ab 0,5 mm posterior zu Bregma, in denen die Darstellung des
Ventrikelsystems und der implantierten CellBeads® möglich wurde, bis etwa 6
mm posterior zu Bregma gefriergeschnitten. Die Aufnahme der Bereiche von 1
mm bis 6 mm posterior zu Bregma ermöglichte die Auswertung der gesamten
Ausdehnung des Schädel-Hirn-Traumas. Es wurden für jedes Versuchstier 20
Objektträger mit jeweils 6 Gewebeschnitten aufgenommen und der Verlauf der
Anfertigung der Gewebeschnitte wurde entsprechend protokolliert.
Das Protokoll der Gefrierschneidetechnik ist im Anhang aufgeführt.
3.5.5 Färbungen
3.5.5.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)
Jeder Objektträger innerhalb der Biokompatibilitätsuntersuchung und jeder
dritte Objektträger im Rahmen der Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1
wurde zur Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin-Eosin (H.E.) angefärbt. Bei der
H.E.-Färbung stellt sich der Kern der Zelle durch Bindung des Hämatoxylins an
das basophile Chromatin blau dar. Die zytoplasmatischen Proteine werden
durch Salzbildung der Eosinanionen mit den positiven Proteingruppen rot
gefärbt.
Zuerst wurden die Objektträger bei Raumtemperatur für 30 Minuten aufgewärmt
und getrocknet, dann für 3 Minuten in Hämatoxylin-Lösung inkubiert, 5 Minuten
in Leitungswasser gespült, 1 Sekunde in HCl-Ethanol differenziert und 1 Minute
60
in Eosin-Lösung inkubiert. Nach erneuter Spülung erfolgte die Entwässerung
und das Eindecken der Objektträger. Das Protokoll ist im Anhang
wiedergegeben.
Für eine spezifische Beurteilung des morphologischen Gewebeaufbaues
dienten immunhistologische Färbungen.
3.5.5.2 Nissl-Färbung
Für jedes Tier wurden die Objektträger ausgewählt, auf denen der größte
Querschnitt des Traumas sichtbar war und mindestens 2 Objektträger pro Tier
wurden mit Hilfe von Kresylechtviolett zur selektiven Darstellung der Neurone
angefärbt. Mit Hilfe dieser auch als Nissl-Färbung bezeichneten Methode
werden selektiv die Zellkörper der Neurone angefärbt, da nur diese im Vergleich
zu Gliazellen eine große Menge Nisslschollen (Stapel des rauhen
endoplasmatischen Retikulums) im Zytoplasma besitzen.
Bei der Nissl-Färbung handelt es sich um eine etablierte Technik zur
neuropathologischen Untersuchung der neuronalen Zytoarchitektonik.
Histologisch zeigten die Nisslschollen eine intensiv blau-violette Färbung,
während sich Kernmembranen, das Zytoplasma der Ganglienzellen und die
Gliazellen blassblau darstellten. Die zerebralen Zellfortsätze wie Dendriten und
Axone blieben bei dieser Technik ungefärbt. Auch die Astrozyten, als ein
Bestandteil
der
Makroglia,
konnten
aufgrund
ihrer
fehlenden
Zytoplasmabasophilie mit der Nissl-Methode nicht gesamt dargestellt werden.
Aus diesem Grund wurden innerhalb der vorliegenden Arbeit spezifische,
immunhistologische Techniken eingesetzt, die in den folgenden Kapiteln
beschrieben werden. Die Objektträger wurden 30 Minuten aufgetaut, für 8
Minuten in einer Kresylechtviolett-Lösung inkubiert, 10 Sekunden in einem
Gemisch aus destilliertem Wasser und Essigsäure differenziert, mit Alkohol
entwässert, erneut 1 Sekunde differenziert mit einer Lösung aus Ethanol und
Essigsäure, final mit Isopropanol entwässert und eingedeckt.
Das Protokoll der Nissl-Färbung ist im Anhang aufgeführt.
61
3.5.6 Immunhistologie
Primärantikörper
Für die immunhistologische Untersuchung wurden Primärantikörper gegen
folgende Zellstrukturen oder Proteine eingesetzt: Antikörper gegen GLP-1
(Rabbit-polyclonal-antiserum to GLP-1, GA 1176 von Biomol), MAP-1
(Monoclonal Mouse-anti-MAP-1 M 4278 von Sigma), GFAP (Polyclonal Rabbitanti-Cow-GFAP, Z 0334 von Dako), und OX6 (Monoclonal Mouse-anti-Rat MHC
II, MAK 0046R von Linaris), denen sich eine Kerngegenfärbung mit
Hämatoxylin zur besseren Übersicht anschloss.
Vor dem Einsatz der Primärantikörper wurde eine Blockierung der endogenen
Peroxidase durchgeführt, die zu einer unspezifischen Reaktion und
Hintergrundfärbung
im
Rahmen
der
angewandten
Peroxidase-
Visualisierungstechnik führen kann. Dies erfolgte mit Hilfe einer Präinkubation
mit einer Wasserstoffperoxid-haltigen Methanollösung (4 ml 30%iges H2O2 und
196 ml Methanol) für 15 Minuten unter Lichtausschluss. Nach durchgeführten
Spülschritten mit einer Tween®-haltigen Lösung zur Senkung der
Oberflächenspannung wurden die Primärantikörper in eine phosphatgepufferte
Kochsalzlösung in entsprechender Verdünnung über 24 Stunden bei 4°C
inkubiert. Zur Absättigung kam als Proteinzusatz bovines Serumalbumin zum
Einsatz.
Die detaillierten Färbeprotokolle sind im Anhang einzusehen.
Es wurden mindestens drei Objektträger pro Tier mit den vier Primärantikörpern
im Bereich der maximalen Traumaausprägung gefärbt.
62
Tabelle 3: Übersicht der verwendeten Primärantikörper
Art der Antikörper (AK), Verdünnung und Klon, monoklonal (MK), polyklonal
(PK), Vorkommen, Funktion und Zielzellen oder Zielgewebe der AK
Antikörper Verdünnung/ Vorkommen
Klon
GLP-1
1:500
PK
MAP-1
1:500
MK
GFAP
1:200
PK
OX6
1:100
MK
Funktion
Zielzellen/
-gewebe
u.a. Darm,
Gehirn
Glucagon-like
Implantate,
Peptide-1 mit
exogenes
3,3 kD,
GLP-1
Regulation des
Zuckerhaushaltes,
Neuroprotektivum
Axone/
MicrotubuleAxone/
Dendriten
associated Protein-1 Dendriten
mit 350 kD,
Bestandteil
des Zytoskeletts,
Indikator für
Verletzungen des
Zytoskeletts
Glia ubiquitär
Saures
Astrozyten
Gliafaserprotein,
Intermediärfilament
des Zytoskeletts,
mit 50 kD,
Indikator de- und
regenerativer
Prozesse
Mikroglia
MHC Typ II
HortegaOberflächenantigen,
zellen
aktivierte Mikroglia
Sekundärantikörper
Zur Bindung der aus Kaninchen stammenden polyklonalen Primärantikörper für
die immunhistologische Untersuchung von GLP-1 und GFAP, wurden
biotinylierte Sekundärantikörper aus Schweinen (Swine-anti-Rabbit E 0353 von
Dako) in Verdünnungen von 1:100 und 1:400 verwendet. Zur Bindung der
monoklonalen Primärantikörper zur Untersuchung von MAP-1 und OX6, die aus
63
Mäusen gewonnen wurden, kamen Sekundärantikörper aus Ziegen (Goat-antimouse E 0433 von Dako) in Verdünnungen von 1:400 und 1:50 zum Einsatz.
Zur Absättigung des Rattengewebes und der Antikörperlösungen wurden
normales Rattenserum (X 0912 von Dako) und die Normalseren der
entsprechenden Tierspezies, normales Schweineserum (X 0901 von Dako) und
normales Ziegenserum (EZN 1000 von Linaris), eingesetzt.
Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Sekundärantikörper
Art des Antikörpers, Verdünnung und Anwendung des Sekundärantikörpers
Antikörper
Verdünnung
Swine-anti-Rabbit-AK
1:400
1:100
Goat-anti-Mouse-AK
1:400
1:50
Anwendung
Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1)
Saures Gliafaserprotein (GFAP)
Microtubule-associated Protein-1
(MAP-1)
MHC Typ II auf Mikroglia (OX6)
Die Visualisierung der Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgte mit Hilfe des
Meerrettichperoxidase-konjugierten Streptavidin-Biotin-Komplexes (K 0377 von
Dako), dessen freie Stelle des Avidins die Bindung an das Biotin des
Sekundärantikörpers ermöglichte. Die enzymatische Reaktion konnte anhand
des Chromagens Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (S 3000 von Dako) und
mit Hilfe von Wasserstoffperoxid als brauner Niederschlag sichtbar gemacht
werden.
3.5.6.1 Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1)
Das Glucagon-like Peptide-1 nimmt als 3,3 kDa großes intestinales Inkretin
Einfluss
auf
die
Regulation
des
Glukosehaushaltes
und
der
Nahrungsaufnahme. In der vorliegenden Arbeit wurde es als mögliches
neuroprotektives Protein eingesetzt, das von den verkapselten, implantierten
Stammzellen sezerniert wurde. Mit Hilfe des Primärantikörpers gegen GLP-1
sollte zum einen die Proteinproduktion innerhalb der Implantate bewiesen
64
werden, zum anderen diente er als Nachweis der Freisetzung aus den
CellBeads® und damit der exogenen Zuführung des Wirkstoffes.
3.5.6.2 Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1)
Das Microtubule-associated Protein-1 ist eine ubiquitär vorkommende
Komponente des zerebralen Zytoskeletts, das beteiligt ist an mikrotubulären,
dendritenspezifischen Funktionen wie zellulärem Transport, neuronalem
Wachstum und der Aufrechterhaltung neuronaler Prozesse. MAP-1 tritt in
hohen Konzentrationen in Dendriten und in niedrigeren Konzentrationen in
Axonen auf. Dendriten gehen als Zellausläufer vom Perikaryon der Nervenzelle
ab. Im Inneren liegen Teile des granulierten ER, Mitochrondrien,
Neurofilamente
und
longitudinal ausgerichtete Mikrotubuli. Es hat
stabilsierenden und beschleunigenden Effekt auf die Polymerisation der
Mikrotubuli. Bei Zerstörungen der labilen Mikrotubuli wird eine Polymerisation
verhindert. MAP-1 ist ein sehr sensitives Protein, das nach Verletzungen des
Zytoskeletts schnell hoch reguliert wird. Der Primärantikörper gegen MAP-1
ermöglichte eine selektive Färbung des Zytoskeletts, besonders der apikalen
Dendriten im zerebralen Kortex.
3.5.6.3 Gliafaserprotein (GFAP)
Das saure Gliafaserprotein oder auch Glial fibrillary acidic Protein, ein
intrazytoplasmatisches filamentäres Protein, bildet einen Bestandteil des
Zytoskeletts in ausgereiften Astrozyten. Es diente als spezifischer Marker für
Zellen astrozytärer Herkunft zur Beurteilung de- und regenerativer Prozesse.
Nach einem Trauma zeigen die Astrozyten eine Proliferation und eine extensive
Hypertrophie der Zellkörper. GFAP wird nach zerebralen Verletzungen merklich
hochreguliert mit einer starken Anfärbung reaktiver Astrozyten.
65
3.5.6.4 MHC Typ II Oberflächenantigen (OX6)
Die intrazerebrale Mikroglia, residente in der Embryonalzeit eingewanderte
immunkompetente
Zellen,
stellen
einen
zentralen
Faktor
im
Abwehrmechanismus des Gehirns gegen eine Vielzahl von Noxen dar. Die
aktivierte Mikroglia bildet ein Netzwerk zur Immunüberwachung, welches
Antigenstrukturen präsentiert (MHC Typ II Expression). Die zelluläre
Entzündungsreaktion wurde mit Antikörpern gegen OX6 zum Nachweis
aktivierter Mikroglia gezeigt, die sich nach Verletzungen durch eine starke
Anfärbung der mikrogliären Hortegazellen darstellen.
3.5.7 Mikroskopische Auswertung
Die Beurteilung der Gewebeschnitte erfolgte lichtmikroskopisch mit dem
Mikroskop Olympus BX50 F4, die fotografische Dokumentation der
histologischen Präparate mittels einer digitalen Kamera (Leica DC 300). Die
Bilddokumente wurden als Dateien im JPEG-Format gespeichert.
Die Benennung der Dateien fand nach folgendem Schema statt:
Tiernummer/ Objektträgernummer/ Nummer des Gewebeschnittes/
Vergrößerung/ Färbemethode (Beispiel: GLP3_1.2_5x_HE.jpg).
Der Schwerpunkt der mikroskopischen Auswertung war innerhalb der
Biokompatibilitätsuntersuchung die Beurteilung der Umgebungs- oder
Abstoßungsreaktion auf die leeren CellBeads® und die Implantate mit der
xenogenen Zelllinie im Vergleich zwischen einem immundefizienten und einem
immunkompetenen Rattenstamm.
Im Rahmen der Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei einem
Schädel-Hirn-Trauma erfolgte eine histologische und immunhistologische
Bewertung der traumatisierten Hemisphäre mit der Untersuchung der
geweblichen, posttraumatischen Morphologie der fokalen, kortikalen
Kontusionsverletzung unter verschiedenen Gesichtspunkten. Desweiteren
wurde ein histologischer und immunhistologischer Nachweis der Implantate und
der Proteinfreisetzung angestrebt.
66
Zur Abschätzung der Folgezustände des Schädel-Hirn-Traumas wurden der
kontusionelle Kortex, die perikontusionelle Zone und das benachbarte
Marklager untersucht. Dabei sollte der histologische Einfluss der Behandlung
der Tiere mit GLP-1 auf die Folgezustände des induzierten Schädel-HirnTraumas im zeitlichen Rahmen von 4 und 8 Wochen nach den Operationen
untersucht werden. Neben der Beurteilung der neuronalen Zelluntergänge,
Störungen der neuronalen Zellarchitektur und Verletzungen des Zytoskeletts,
wurden sowohl degenerative Prozesse als auch entzündliche Vorgänge
innerhalb der Traumaregion berücksichtigt.
Die Interpretation der Untersuchungsergebnisse erfolgte auf histologischer und
immunhistologischer Basis anhand einer qualitativen Auswertung der H.E.- und
Nissl-Färbung und mittels einer semiquantitativen Analyse mit Kategorisierung
der Ergebnisse im Rahmen der Immunhistologie.
Alle Veränderungen wurden bei der GLP-1- und MAP-1-Färbung als positiv
oder negativ gegenüber dem Status der Kontrolltiere unterteilt. Bei der GFAPund OX6-Färbung erfolgte eine Graduierung in 3 Schweregrade (geringe,
moderate und massive Zunahme der Immunreaktion). Diese Einteilung wurde
der entsprechenden immunhistologischen Technik angepasst, definiert und für
alle Versuchstiere durchgeführt. Die Gesamtbeurteilung wurde tabellarisch und
graphisch ausgedrückt. Die Abbildungen 11 bis 17 zeigen die definierten
Graduierungen und die Schwerpunkte der Untersuchung.
3.5.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)
Die histologische Untersuchung anhand der H.E.-Färbung diente der
Übersichtsfärbung und dem Nachweis der Implantate. Im Rahmen der
Wirksamkeitsuntersuchung wurden zudem die morphologischen, geweblichen
Veränderungen nach dem Schädel-Hirn-Trauma beurteilt. Dabei wurde der
Bereich der
Kontusion, die kontusionellen Randgebiete und das
Ventrikelsystem berücksichtigt.
67
3.5.7.2 Nissl-Färbung
Die
Nissl-Färbung
wurde
zur
qualitativen
Untersuchung
der
Neuronenmorphologie nach der kontusionellen Gehirnverletzung eingesetzt.
Dabei wurden sowohl die neuronalen Veränderung des gesamten Kortex im
kontusionellen Bereich und in den Kontusionsrandgebieten, bevorzugt in der
Lamina pyramidalis externa, betrachtet.
Der Einsatz des Primärantikörpers gegen das Glucagon-like Peptide-1 diente
dem Nachweis der Proteinsekretion innerhalb der Implantate und damit der
Funktionsfähigkeit der Implantate. Dabei erfolgte die immunhistologische
Nachweisführung bei 4 behandelten Tieren. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurde
bei je 1 Tier der Versuchsgruppe der Kontolltiere, der Tiere, bei denen nur ein
Trauma induziert wurde, und der Gruppe der Implantation leerer CellBeads®,
eine immunhistologische Untersuchung mit Hilfe des GLP-1-Antikörpers
durchgeführt. Die Ergebnisse wurden klassifiziert in eine positiven und
negativen Immunreaktion.
A
B
Abbildung 11
Darstellung der Auswertung und Graduierung der GLP-1-Färbung
A : Übersicht eines Gehirns bei 12,5 facher Vergrößerung, Schwerpunkt der
Untersuchung im Bereich des Ventrikel, des angrenzenden Gewebes und innerhalb
der Kontusion (markiert mit Rahmen), Messbalken 800 µm
B: CellBead® bei 200facher Vergrößerung, positive Immunreaktion der GLP-1
sezernierenden Stammzellen (Pfeile), Messbalken 50 µm
68
Mit Hilfe der immunhistologischen Anfärbung des Microtubule-associated
Protein-1 wurden die posttraumatischen Zytoskelettverletzungen untersucht.
Für jedes Tier wurde der Bereich der maximalen Traumaausprägung beurteilt.
Als Schwerpunkt der Untersuchung diente eine Bewertung der dendritischen
Strukturen innerhalb des kontusionellen Kortex. Aufgrund der anatomischen
Faserverläufe der Dendriten wurde in die Analyse neben der Lamina
pyramidalis externa, die oberhalb angrenzende Lamina granularis externa
miteinbezogen, da die Spitzendendriten der Pyramidalschicht bis in diese Zone
hineinreichen.Die Färbung wurde anhand einer Klasifikation in eine positive
und negative Immunreaktion ausgewertet.
Abbildung 12
MAP-1 Immunhistologie
Übersicht eines Gehirns bei 12,5facher Vergrößerung,
Schwerpunkt der Untersuchung im
Bereich der kortikalen Lamina
granularis externa und Lamina
pyramidalis externa (markiert mit
Rahmen), Messbalken 800 µm.
A
B
Abbildung 13
Darstellung der Graduierung der MAP-1-Färbung bei 400facher Vergrößerung,
Messbalken 25 µm
A: positive Immunreaktion der apikalen, kortikalen Dendriten (Pfeile)
B: negative Immunreaktion ohne Anfärbung des Zytoskeletts
69
Das saure Gliafaserprotein diente der Darstellung aktivierter Astrozyten zur
Beurteilung der Makroglia unter Berücksichtigung degenerativer Prozesse.
Im Rahmen der Untersuchung wurde der traumatisierte Kortex und der
angrenzende Balken ausgewertet. Untersucht wurde die globale Zunahme der
Intensität der GFAP-Immunrektion mit Beurteilung der angefärbten Astrozyten
in 3 Kategorien:
Geringe Zunahme der Immunreaktion: reguläres Muster der Astrozyten mit
fokal begrenzter Anfärbung einzelner Astrozyten.
Moderate Zunahme der Immunreaktion: Zunahme der Immunreaktion mit
verstärkter flächiger Anfärbung der Astrozyten ohne Ausbildung einer
Glianarbe.
Massive Zunahme der Immunreaktion: Starke Zunahme der globalen
Immunintensität im gesamten dargestellten Areal mit einer Verdichtung und
narbiger Abgrenzung (Glianarbe) des Kontusionsdefektes.
Abbildung 14
GFAP- Immunhistologie
Übersicht eines Gehirns bei 12,5
facher Vergrößerung,
Bereich der Kontusion, der
Kontusionrandzone und des
angrenzenden Balkens (Rahmen),
Messbalken 800 µm
70
A
B
C
D
E
F
Abbildung 15
Darstellung der Graduierung der GFAP-Färbung bei 400facher Vergrößerung
(außer E), Messbalken 25 µm
A/B: Geringe Immunreaktion mit Anfärbung einzelner Astrozyten (Pfeile).
C/D: Moderate Immunreaktion mit zunehmend flächiger Anfärbung der Astrozyten
E/F: Massive Immunreaktion mit Ausbildung einer Glianarbe, bei 12,5fach
vergrößerter Übersichtsaufnahme, Messbalken 800 µm (E), Ausschnittsvergrößerung
des astrozytären Narbenbereiches (F)
71
Zur Beurteilung immunologischer Prozesse wurde die Aktivierung der Mikroglia
mittels immunhistologischer Darstellung der MHC Typ II-Expression auf den
zerebralen Hortegazellen herangezogen.
Sie diente der Untersuchung der immunologischen Abwehrreaktion im Bereich
der maximalen Traumaausprägung als Folge der experimentellen
Gehirnverletzung.
Die Kategorisierung der Ergebnisse erfolgte unter Berücksichtigung der
vermehrten Ausprägung der Hortegazellen innerhalb des Kortex und des
Marklagers. Die Schweregrade der Immunreaktion wurden unter Bezugnahme
auf den Status der gesunden Kontrolltiere in 3 Schweregrade eingeteilt:
Geringe Zunahme der Immunreaktion: vereinzelte oder fokal begrenzte
immunpositive Mikrogliazellen nachweisbar.
Moderate Zunahme der Immunreaktion: gesteigerte Immunreaktion innerhalb
des Marklagers und des ventralen Kontusionsrandes, Reaktion auf ipsilaterale
Traumaseite begrenzt.
Massive Zunahme der Immunreaktion: schwerwiegende Immunreaktion mit
starker
Aktivierung
der
Mikroglia
innerhalb
der
Kontusion,
des
Kontusionsrandes und des Marklagers, auf ipsi- und contralateraler
Traumaseite. Kortikale, mikrogliäre Reaktionen mit Ausbildung von
Traumamarken.
Abbildung 16
OX6-Immunhistologie
Übersicht eines Gehirns bei 12,5
facher Vergrößerung,
Bereich der Kontusion, des
ventralen Kontusionsrandes und
des Marklagers (Rahmen),
Messbalken 800 µm
72
A
B
C
D
E
F
Abbildung 17
Darstellung der Graduierung der OX6-Färbung bei 400facher Vergrößerung
(außer E), Messbalken 25 µm
A/B: Geringe Immunreaktion: vereinzelte immunpositive Mikrogliazellen (Pfeile)
und fokal begrenzte Immunreaktion (B)
C/D: Verstärkte, moderate mikrogliäre Reaktion, innerhalb der Kontusion (C) und am
Übergang von ventralem Kontusionsrand zum angrenzenden Marklager (D)
E/F: Massiven, bilateralen Immunreaktion mit kortikaler Ausbreitung und Bildung
einer Traumamarke, Übersichtsaufnahme bei 40facher Vergrößerung, Messbalken 40
µm (E), Ausschnittsvergrößerung des Bereiches zwischen Kortex und Marklager (F)
73
3.6 Statistische Auswertung
Die Daten der Untersuchungen der motorischen und kognitiven Leistung
wurden als arithmetische Mittelwerte statistisch ausgewertet.
Die arithmetischen Mittelwerte der Versuchstage ergaben sich aus der Summe
der Einzelwerte der Versuchsdurchgänge geteilt durch die Anzahl der
Tagesdurchgänge. Anhand der Einzeldaten wurden die entsprechenden
Gruppenmittelwerte bestimmt.
Die statistische Auswertung erfolgte mit einer mehrfaktoriellen Varianzanalyse
(Factorial ANOVA). Hiermit konnte untersucht werden, ob mehrere
unabhängige Variablen (oder Faktoren) einzeln oder in beliebiger Kombination
einen statistisch gesicherten Einfluß auf ein Merkmal (abhängige Variable)
haben. Mit der Varianz wurde die mittlere quadratische Abweichung der Daten
vom Mittelwert beschrieben. Um feststellen zu können, welche der untersuchten
4 Versuchsgruppen sich im einzelnen unterschieden, wurden Einzelvergleiche
durchgeführt (Fischer-Test).
Für die einzelnen Gruppen wurden das arithmetische Mittel, die
Standardabweichung (SD), der Standardfehler (SEM) und die Minimal- und
Maximalwerte berechnet.
Die Varianzanalyse und der Fischer-Test wurden mit dem Programm Statview
durchgeführt und die Ergebnisse graphisch dargestellt. Als signifikant galt eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05.
Die detaillierten Daten der deskriptiven Statistik und des Fischer-Tests sind im
Anhang aufgeführt.
4 Ergebnisse
74
4 Ergebnisse
4.1 Biokompatibilitätsuntersuchung
4.1.1 Koordinaten zur zerebralen Implantation
Anhand histologischer Auswertungen an H.E.-gefärbten Gefrierschnitten
konnten folgende Koordinaten zur zerbralen Implantation ermittelt werden, die
innerhalb der Untersuchung der Biokompatibilität und im Rahmen der Analyse
der Wirksamkeit des GLP-1 Anwendung fanden: posterior 1 mm, lateral 2 mm
und ventral 5 mm zu Bregma. Mit Hilfe dieser Werte wurde eine
reproduzierbare, intrazerebrale Verabreichung der Implantate unter
Kontaktaufnahme mit dem liquorführenden System gewährleistet. Die
Abbildung 18 zeigt exemplarisch die durch die Implantation verursachten
geweblichen Stichkanäle.
B
A
SK
SK
Ventrikel
Abbildung 18
Histologische Darstellung der Stichkanäle (SK) im Bereich der
rechten Hemisphäre bei 25facher Vergrößerung, Messbalken 400 µm
A: Implantation ohne Kontaktaufnahme mit dem zerebralen Ventrikelsystem
B: Implantation mit Eröffnung des rechten Seitenventrikels
4 Ergebnisse
75
4.1.2 Untersuchung der Umgebungsreaktion
Ziel dieser Untersuchung war die Beurteilung der intrazerebralen Verträglichkeit
des Alginates und die Biokompatibilität alginatverkapselter humaner
Stammzellen im Rahmen eines intakten, biologischen Systems.
Für eine Versuchsdauer von 8 Wochen wurden leere CellBeads® und
Implantate mit einer xenogenen Zelllinie (hMSC) bei sowohl immundefizienten
(RNU/Ztm) als auch immunkompetenten Versuchstieren (BD IX/Ztm)
intrakraniell implantiert und histologisch anhand H.E.-gefärbter Gefrierschnitte
lichtmikroskopisch ausgewertet. Dabei zeigte keines der Tiere eine Störung des
Allgemeinbefindens als Folge des Implantationsverfahrens.
Als Schwerpunkt der Auswertung galt die Untersuchung einer möglichen akuten
oder chronischen Abstoßungsreaktion durch das Empfängertier.
Eine entzündliche Gewebsinfiltration und eine Fibrosierung dienten hierbei als
Kennzeichen einer geweblichen Umgebungs- oder Abstoßungsreaktion.
Bei den insgesamt 24 operierten Tieren konnte bei 16 Tieren histologisch eine
erfolgreiche Implantation nachgewiesen werden. Die Implantationen erfolgten
bei 13 Tieren in den rechten Seitenventrikel, während bei 3 Tieren die
CellBeads® intraparenchymal verabreicht wurden.
Eine detaillierte Übersicht der Implantationserfolge ist in der Tabelle 5
einzusehen.
Bei mikroskopischer Betrachtung der in das Gehirngewebe implantierten
CellBeads® wiesen sowohl die leeren als auch die humane Stammzellen
enthaltenden Implantate deutliche Cavitäten im Bereich der äußeren
Alginatkapsel auf, deren Alginatanteile histologisch nur unvollständig dargestellt
werden konnten. Der innere, Goldpartikel enthaltende Core der leeren
CellBeads® zeigte sich meist deformiert, während der Zellcore der xenogenen
Zelllinie meist vollständig, zentral und gleichmäßig groß dargestellt werden
konnte. Das umliegende Gewebe war charakterisiert durch eine gut erhaltene
Neuronenstruktur ohne Ausbildung einer Gliareaktion. Vereinzelt konnten
4 Ergebnisse
76
gelbliche Aggregate als Produkte des Hämoglobinabbaus in der Umgebung der
Implantate beobachtet werden.
Bei den immunkompetenten Tieren wurde eine geringe Kapillarvermehrung mit
leichtgradiger Hyperämie in der Umgebung der CellBeads® festgestellt,
während eine Implantation bei den immundefizienten Tieren mit keinerlei
Kapillaraktivierung oder vaskulärer Einsprossung verbunden war.
In den Bereichen um die Implantate zeigte sich eine endotheliale Auskleidung
der durch die Implantation entstandene Höhle.
Sowohl bei dem immundefizienten als auch bei dem immunkompetenten
Rattenstamm wurden zudem keine geweblichen Anzeichen einer möglichen
akuten oder chronischen Abstoßungsreaktion durch entzündliche Infiltrate oder
fibrotische Veränderungen festgestellt. Dies spricht für eine durch die
eingesetzte Verkapselungstechnik gesicherte Immunabschirmung der
Implantate.
Bei den histologischen Untersuchungen der in den rechten Seitenventrikel
implantierten CellBeads® waren diese nachweislich bevorzugt an der Wand des
Ventrikels oder in Anlagerung an das Ependym der Plexus chorioidei
auffindbar. In den histologischen Betrachtungen erwies sich der innere Core der
leeren und der xenogenen CellBeads® als meist unvollständig und verformt.
Hinsichtlich
der
Umgebungsreaktionen
konnten
in
Bezug
zur
intraparenchymalen Implantation keine abweichenden Befunde gestellt werden.
Die Abbildungen 19 bis 21 zeigen exemplarisch die histologische Darstellung
der intraparenchymal und ventrikulär implantierten CellBeads®.
Im Rahmen der Beurteilung der Biokompatibilität wurden außerdem humane
Stammzellen enthaltende Implantate durch eine Explantation gewonnen und
auf ihre Morphologie untersucht. Ferner wurden diese durch den Hersteller
einer Vitalitätsuntersuchung unterzogen.
Die
Ergebnisse
der
morphologischen
Untersuchung
und
der
Vitalitätsbestimmung der Explantate sind in den Kapiteln 4.1.3 und 4.1.4
beschrieben.
4 Ergebnisse
77
A
B
Ventrikel
Alginat
Goldpartikel
C
D
Zellcore
Abbildung 19
Histologische Darstellung von CellBeads® im Gehirngewebe (H.E.)
nach einer Implantationsdauer von 8 Wochen bei 100facher
(A/C: Messbalken 100 µm) und 400facher Vergrößerung (B/D: Messbalken 25 µm)
A/B: Intraparenchymale Implantation leerer CellBeads® in der Nähe
des rechten Seitenventrikels bei einem immunkompetenten Rattenstamm
(BD IX/Ztm), geringgradige implantationsbedingte Einblutungen (Pfeil) sichtbar
ohne Anzeichen einer Abstoßungsreaktion (A), innerhalb der Höhlenbildung
Goldpartikel und Kapselreste erkennbar (B)
C/D: Intraparenchymale Implantation von CellBeads® mit xenogener Zelllinie
bei einem immundefizienten Tier (RNU/Ztm), ohne enzündliche Infiltration
oder Kapillaraktivierung (C), epitheliale Auskleidung der Implantationshöhle (Pfeil) und vollständiger, geformter innerer Zellcore sichtbar (D)
4 Ergebnisse
78
A
B
C
D
Abbildung 20
Histologische Darstellung von CellBeads® im Gehirngewebe (H.E.)
nach einer Implantationsdauer von 8 Wochen bei einem immunkompetenten
Tier (BD IX/Ztm) mit xenogener Zelllinie (hMSC) bei 100facher
(A/C, Messbalken 100 µm) und 400facher Vergrößerung (B/D, Messbalken 25 µm)
A/B: Intraparenchymale Implantation, 2 CellBeads® mit fast vollständigem inneren
Zellcore erkennbar, geringgradige Hyperämie am oberen Rand der Implantationshöhle
(Pfeile) mit verstärkter vaskulärer Blutfülle, keine Anzeichen einer entzündlichen
Infiltration oder Fibrosierung nachweisbar
C/D: Intraparenchymale Implantation, ohne Anzeichen einer Abstoßungsreaktion (C), äußere Alginatkapsel (Pfeil) und innerer Zellcore darstellbar (D)
4 Ergebnisse
79
B
A
Abbildung 21
Histologische Darstellung von CellBeads® im rechten Seitenventrikel (H.E.)
nach einer Implantationsdauer von 8 Wochen bei einem immunkompetenten (A)
und einem immundefizienten Tier (B) bei 400facher Vergrößerung, Messbalken 25 µm
A: CellBead® mit xenogener Zelllinie (hMSC) Alginatkapselreste und unvollständiger
innerer Zellcore sichtbar
B: Leerer CellBead® mit deformiertem Core, Goldpartikel und Alginatanteile erkennbar.
Tabelle 5: Übersicht der Implantationserfolge
Implantate, Anzahl der Tiere, bei denen die Implantate histologisch
nachgewiesen werden konnten, Lokalisation der Implantate und Tieranzahl der
durchgeführten Explantationen
Implantate
Gruppe I
Implantation
leerer
Cellbeads®
Gruppe II
Implantation
Cellbeads® mit
xenogener
Zelllinie
(hMSC)
CellBeads® CellBeads®
Lokalisation
Anzahl
histologisch histologisch der Implantate
Tiere,
nachweisbar nachweisbar
CellBeads®
(RNU/Ztm)
(BD IX/Ztm)
explantiert
4 von 6
5 von 6
Ventrikel:
kein Tier
Tieren
Tieren
4 Tiere (RNU)
4 Tiere (BD IX)
Gewebe:
1 Tier (BDIX)
4 von 6
3 von 6
Ventrikel:
5 Tiere:
Tieren
Tieren
3 Tiere (RNU)
3 BD IX
2 Tiere (BD IX)
2 RNU
Gewebe:
1 Tier (RNU)
1Tier (BD IX)
4 Ergebnisse
80
4.1.3 Explantation der CellBeads® nach Langzeitimplantation
Von den jeweils 10 pro Tier verabreichten CellBeads® konnten bei der
Explantation aus 3 immunkompetenten Tieren (BD IX/Ztm) 9, 7 und 6, bei der
Entnahme aus 2 immundefizienten Tieren (RNU/Ztm) 5 und 10 Implantate mit
xenogener Zelllinie (hMSC) gewonnen werden.
Die Implantate waren bei der Entnahme schwierig aufzufinden und zu
entnehmen. Bei einer lichtmikroskopischen Betrachtung in-toto zeigten sie
keinerlei morphologische Veränderungen. Die CellBeads® wiesen strukturell
einen gleichmäßigen, vollständigen inneren Zellcore, eine stabile Konsistenz
und eine intakte äußere Alginatkapsel auf.
Zur Beurteilung der Vitalität und Funktionsfähigkeit wurden die gewonnenen
Explantate in einem Versandmedium zu dem Hersteller verschickt.
In der Abbildung 22 sind exemplarisch lichtmikroskopische Ansichten der
explantierten CellBeads® dargestellt.
A
B
Abbildung 22
Lichtmikroskopische Darstellung explantierter CellBeads®
nach Langzeitimplantation von 8 Wochen bei 50facher (A, Messbalken 50 µm) und
100facher Vergrößerung (B, Messbalken 25 µm)
A/B: Morphologische Ansicht der Explantate, Gewebereste, vollständiger
innerer Zellcore und intakte äußere Alginatkapsel (Pfeil) erkennbar
4 Ergebnisse
81
4.1.4 Vitalitätsuntersuchung der explantierten CellBeads®
Die Vitalitätsuntersuchung der durch Explantation gewonnenen CellBeads® mit
xenogener Zelllinie erfolgte durch den Hersteller der Implantate anhand einer
dualen Fluoreszenzmethode. Jeweils 1 explantierter CellBead® aus jedem der 5
Versuchstiere, bestehend aus 2 immundefizienten (RNU/Ztm) und 3
immunkompetenten Tieren (BD IX/Ztm), wurde mit dem Fluoreszenzfarbstoff
SYBR Green in Kombination mit Propidiumjodid angefärbt. Die Auswertung
wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen. Als Merkmal der
Vitalität galt eine grünliche, fluoreszierende durch SYBR vermittelte Markierung
der verkapselten Zellen, während sich tote Zellen durch Propidiumjodid rot
darstellten. Im Rahmen der Untersuchung konnte sowohl bei dem
immundefizienten als auch bei dem immunkompetenten Rattenstamm eine
hohe Vitalität der verkapselten humanen Stammzellen nach einer
Langzeitimplantation von 8 Wochen nachgewiesen werden. Bei allen Tieren
wurde bei 98% der verkapselten Stammzellen innerhalb der CellBeads® eine
SYBR-positive Reaktion beobachtet.
Im Rahmen der Biokompatibilitätsuntersuchung konnte festgestellt werden,
dass nach einer Langzeitimplantation von CellBeads® nach 8 Wochen weder
bei den immundefizienten noch bei den immunkompetenten Tieren
Nebenwirkungen am Implantationsort in Form einer Abstoßungsreaktion
erkennbar waren.
Aufgrund der nachgewiesenen Stabilität der Alginatkapseln und Vitalität der
verkapselten Stammzellen nach der Implantation kann von einer gesicherten
Wirkstofffreisetzung ausgegangen werden.
Anhand der histologischen, morphologischen und funktionellen Untersuchungen
wurde die zerebrale Bioverträglichkeit des Alginates und die Eignung des
Einsatzes verkapselter, humaner Stammzellen im Zentralen Nervensystem
bestätigt.
4 Ergebnisse
82
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma
4.2.1 H.E.-Färbung: Histologischer Nachweis der Implantate
Innerhalb der Wirksamkeitsanalyse des Glucagon-like Peptide-1 bei einem
Schädel-Hirn-Trauma wurde zunächst das Verhalten der CellBeads® nach
Langzeitimplantation mittels H.E.-gefärbter Gefrierschnitte untersucht.
Bei 19 von insgesamt 20 Tieren, bei denen eine ventrikuläre Implantation
vorgenommen wurde, waren CellBeads® histologisch nachweisbar. Es konnten
bis zu 5 CellBeads® in einem Gefrierschnitt gleichzeitig dargestellt werden
(Abbildung 24F). Die Implantate zeigten in der H.E.-Färbung einen teilweise
unvollständigen, geformten Zellcore, mit einer nur fragmentären Darstellung der
Alginatkapsel, während im nativen Zustand alle strukturellen Anteile der
CellBeads® dargestellt werden konnten.
Die Bildabfolge in der Abbildung 23 zeigt exemplarisch durch die Darstellung
mehrerer Schnittebenen desselben Implantates deutlich dessen Aufbau.
Besonderes Augenmerk lag dabei auf den strukturellen Anteilen, insbesondere
der äußeren Alginatkapsel und deren Darstellung im nativen und angefärbten
Zustand. In der Abbildung 24 sind leere und GLP-1 sezernierende CellBeads®
nach einer Implantationsdauer von 4 und 8 Wochen einzusehen.
A
B
Abbildung 23
Darstellung mehrerer Schnittebenen durch einen GLP-1 sezernierenden
CellBead® nach einer Implantationsdauer von 4 Wochen bei 100facher Vergrößerung,
Abstände zwischen den Gefrierschnitten 20 µm, Messbalken 100 µm
A: ungefärbter CellBead®, Kapsel und Zellcore im Verlauf vollständig darstellbar
B: H.E.-gefärbter CellBead® mit Abnahme der Darstellbarkeit der Strukturanteile
4 Ergebnisse
83
A
B
C
D
E
F
G
H
Abbildung 24
Histologische Darstellung von CellBeads® im rechten Seitenventrikel (H.E.)
bei 12,5facher (A/C/E/G, Messbalken 800 µm), 100facher (F, Messbalken 100 µm)
und 200facher Vergrößerung (B/D/H, Messbalken 50 µm)
A-D: Ventrikulär implantierte leere CellBeads ® nach 4 (A/B) und 8 Wochen (C/D)
E-G: Ventrikulär implantierte CellBeads ® mit GLP-1 nach 4 (E/F) und 8 Wochen (G/H)
4 Ergebnisse
84
Tabelle 6: Übersicht der Implantationserfolge
Implantate und Versuchsgruppen, Anzahl der Tiere, bei denen die Implantate
histologisch nachweisbar waren und Lokalisation der Implantate
Implantate
Gruppe III
Implantation leerer
Cellbeads®
Gruppe IV
Implantation GLP-1
sezernierender
Cellbeads®
CellBeads® histologisch
nachweisbar
(SPRD/Ztm)
9 von 10
Tieren
Lokalisation
der Implantate
10 von 10
Tieren
rechter
Seitenventrikel
rechter
Seitenventrikel
4.2.2 Liquoruntersuchung: Nachweis der Proteinfreisetzung
Der Nachweis der Freisetzung des Glucagon-like Peptide-1 nach der
Implantation GLP-1 sezernierender CellBeads® erfolgte durch die Untersuchung
der nach 4 und 8 Wochen gewonnenen Liquorproben mittels eines ELISA (GLP
Active ELISA, Biotrend).
Im Rahmen der Untersuchung konnten für alle 10 mit GLP-1 behandelten Tiere
der Versuchsgruppe IV eine Wirkstofffreisetzung nach 4 und 8 Wochen
bewiesen werden. Nach einer Implantationsdauer von 4 Wochen wurden
Proteinkonzentrationen zwischen 12,4 und 21,8 pM gemessen, im Mittel lagen
sie bei 17 pM. Nach 8 Wochen konnten GLP-1-Konzentrationen zwischen 6,9
und 12,2 pM mit einem Mittelwert von 9,7 pM bestimmt werden.
Zur Kontrollmessung wurden bei jeweils 2 Tieren der Versuchsgruppe II, bei
denen ein Schädel-Hirn-Trauma (CCI) ohne eine Implantation durchgeführt
wurde und der Versuchsgruppe III mit Erzeugung eines Kontusionstraumas
(CCI) und Implantation leerer CellBeads®, eine exemplarische Untersuchung
des Liquors vorgenommen.
Es konnte sowohl bei den Tieren der Versuchsgruppe II als auch bei den Tieren
der Versuchsgruppe III keine GLP-1-Konzentration gezeigt werden.
4 Ergebnisse
85
Anhand der Verwendung der Liquorproben der gesunden Kontrolltiere der
Versuchsgruppe I erfolgte eine Überprüfung der Sensitivität der
Untersuchungsmethode mittels des GLP-1-ELISA. Dazu wurden dem
gesammelten Liquor 10 pM synthetisches GLP-1 zugesetzt und die
Wiederfindungsrate gemessen. Es konnte von den eingesetzten 10 pM GLP-1
6,6 pM im Liquor detektiert werden.
Mit Hilfe der Liquoruntersuchung konnte nach einer Implantationsdauer von 4
und 8 Wochen eine signifikante, kontinuierliche und gleichmäßige
Proteinfreisetzung des GLP-1 gezeigt werden. Eine Übersicht über die
gemessenen Proteinkonzentrationen innerhalb der Liquoruntersuchung gibt die
Abbildung 25.
25
21,8
18,6
18,3
13,8
15
17
12,4
11,7
nur
Trauma
Kontrollbeads
9,7
6,9
6,6
GLP Beads 4 Wochen
GLP Beads 8 Wochen
10pM
GLP
MW
46
45
44
42
MW
20
0
50
0
49
0,1
48
0
47
0
33
0
32
5
22
10
12,2
9,2 8,4
43
20
21
GLP-1 Konzentration [pM]
GLP-1 Konzentration im Liquor
KontrollLiquor
Abbildung 25
Übersicht der Ergebnisse der Liquoruntersuchung
Auf der y-Achse ist die GLP-1-Konzentration im Liquor in pM angegeben
Auf der x-Achse sind die Tiernummern festgehalten
Tiernummer 21/22: Versuchsgruppe II (CCI),
Tiernummer 32/33: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®),
Tiernummer 42 bis 20: Versuchsgruppe IV (CCI und Implantation CellBeads® mit
GLP-1). Mit Hilfe des Kontroll-Liquors der Versuchsgruppe I (Kontrolltiere) wurde nach
Zugabe von 10 pM GLP-1 die Wiederfindungsrate des Proteins im Liquor untersucht.
MW steht für die Mittelwerte der gemessenen Wirkstoffkonzentrationen mit durch
Fehlerbalken gekennzeichneten Standardfehler.
4 Ergebnisse
86
4.2.3 H.E.-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma
Neben einem morphologischen Nachweis der Implantate diente die H.E.Färbung der qualitativen Bewertung der morphologischen posttraumatischen
Veränderungen infolge des experimentellen Schädel-Hirn-Traumas.
Mit Hilfe des Controlled Cortical Impact (CCI) wurde bei 30 Versuchstieren eine
unilaterale, fokale, kortikale und moderate Kontusion erzeugt.
Als Folge der kontusionellen Verletzung zeigten alle Tiere im Bereich der
Kontusion morphologische Hirnsubstanzschädigungen in Form einer kortikalen
Schwellung, die in ihrer Ausprägung innerhalb der Versuchsgruppen variierte.
Eine hochgradige Schwellung war bei allen Tieren der Versuchsgruppe III, bei
denen zusätzlich zur Traumainduktion leere CellBeads® verabreicht wurden,
festzustellen. Bei jeweils 1 Tier nach 4 und 8 Wochen waren innerhalb dieser
Versuchsgruppe außerdem starke zerebrale Nekrosen mit einem Verlust des
parietalen Kortex im Bereich des verletzten, traumatisierten Gewebes
nachweisbar.
Die traumatisierten Tiere der Gruppe II, die einer Kontusionsverletzung ohne
Implantation unterzogen wurden, wiesen eine mittelgradige kortikale
Schwellung auf. Bis auf 1 Tier der Gruppe IV, der mit GLP-1 sezernierenden
CellBeads® behandelten Versuchstiere, waren die geweblichen Veränderungen
in Form einer Gehirnschwellung deutlich vermindert. Die Tiere der Gruppe II
und IV wiesen dabei keine nekrotischen Veränderungen des Kortex auf.
Ein weiterer zentraler Befund der experimentellen Gehirnverletzung war eine
Störung der Liquorzirkulation, die sich bei 4 Tieren der Gruppe II (CCI) , 6
Tieren der Gruppe III (CCI und Implantation leere CellBeads®) und bei 1 Tier
der Gruppe IV (CCI und Implantation GLP-1 sezernierender CellBeads®) in
Form der Ausbildung eines posttraumatischen Hydrozephalus äußerte. In
Verbindung mit der Erweiterung des liquorführenden Systems waren zudem
deutliche atrophische Veränderungen des kontusionellen Kortex nachweisbar.
Weiterhin zeigten einige Tiere dezente intraparenchymale Kleinstblutungen am
Übergang vom Kortex zum angrenzenden Balken.
4 Ergebnisse
87
Die Abbildungen 26 und 27 zeigen exemplarisch die zentralen Befunde der
morphologischen
Untersuchung
der
posttraumatischen
zerebralen
Folgeschäden mit Hilfe der H.E.-Färbung.
A
C
E
B
D
F
Abbildung 26
Morphologische Befunde nach Trauma (H.E.):
Gehirnschwellung, posttraumatischer Hydrozephalus, Atrophie
12,5fache Übersichtsaufnahme nach 8 Wochen, Messbalken 800 µm
A/B: Versuchsgruppe II (CCI) deutliche kortikale Schwellung im Bereich der Kontusion
(A) und starke Ventrikelerweiterung (B) mit mittelgradiger kortikaler Atrophie
C/D: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®), kortikale
Schwellung, hochgradiger posttraumatischer Hydrozephalus (PTH) mit atrophischer
Veränderung in Form einer Abnahme der Kortexdicke (D)
E/F: Versuchsgruppe IV (CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1), deutlich
geringere Ausprägung der Gehirnschwellung (E), ohne Ventrikelerweiterung (F)
4 Ergebnisse
A
88
B
C
Abbildung 27
Morphologische Befunde nach Trauma (H. E.):
Nekrosen und Hämatome
Aufnahmen bei 12,5facher (A/B Messbalken 800 µm)
und 100 facher Vergrößerung (C Messbalken 100 µm)
A/B: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) nach 8 (A)
und 4 Wochen (B) mit starken nekrotischen Veränderungen und einem Verlust
von Anteilen des parietalen Kortex
C: Versuchsgruppe II (CCI) nach 8 Wochen, Kleinsthämatome am Übergang
von Kortex zu Marklager mit dilatierten zerebralen Gefäßen (Pfeile)
4 Ergebnisse
89
4.2.4 Nissl-Färbung: Morphologische Befunde nach Trauma
Zur qualitativen Untersuchung der Neuronenmorphologie nach Induktion einer
Kontusionsverletzung des Gehirns wurden repräsentative Bereiche der
maximalen Traumaausprägung mit der Nissl-Methode angefärbt. Dieses
Verfahren führte zum einen zur Darstellung der Nissl-Schollen im Perikaryon
der Neurone und zum anderen zur Anfärbung der Nervenzellkerne.
Schwerpunkt der Untersuchung war die Bewertung der allgemeinen, den
gesamten Kortex betreffenden strukturellen Zellarchitektonik und die
Betrachtung pyramidaler Zellen. Dabei wurden der anatomische Aufbau der 6schichtigen Hirnrinde mit vertikalen Zellsäulen und die Merkmale gesunder
Pyramidenzellen mit Darstellung des Nucleus mit Nucleolus, der Nissl-Schollen
und der pyramidalen Struktur berücksichtigt.
Im Rahmen der Beurteilung des zerebralen Kortex war insbesondere bei den
Versuchstieren der Gruppe II (CCI) eine deutliche Abnahme der Dichte vital
erscheinender Neurone zu beobachten. Neben einem Verlust der Anzahl der
neuronalen Zellen waren Zellschwellungen und besonders in der Gruppe III
(CCI und Implantation leerer CellBeads®) degenerative Veränderungen in Form
einer tigrolytischen Rückbildung der Nissl-Schollen und fokaler pyknotischer
Zellkernverdichtungen und -schrumpfungen nachweisbar. Alle Tiere zeigten
eine Veränderung der kortikalen Zellstruktur mit einem ödematös
aufgelockerten bis gänzlich aufgelösten kortikalen Zellverband. Dabei wiesen
die mit GLP-1 behandelten Tiere eine gelockerte, aber weitgehend erhaltene
vertikale Zellsäulenstruktur mit einem verminderten neuronalen Zellverlust auf.
Die Abbildung 28 zeigt die mit Hilfe der Nissl-Färbung erhobenen Befunde im
Vergleich der einzelnen Versuchsgruppen.
4 Ergebnisse
A
C
90
B
D
Abbildung 28
Morphologische Befunde nach Trauma (Nissl):
Zellverluste, Zellpyknosen, ödematöse Auflösung des Zellverbandes
innerhalb Lamina pyramidalis externa, nach 8 Wochen bei 400facher
Vergrößerung, Messbalken 25 µm
A: Kontrolltier, vertikale Zellsäulengliederung des Kortex und intakter Zellverband
B Versuchsgruppe II (CCI) mit starker Abnahme der neuronalen Zelldichte
C: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®), ödematöser Verlust
des säulenartigen Zellverbandes, neuronale Zellschwellungen und Kernpyknosen
(exemplarisch Pfeil) sichtbar
D: Versuchsgruppe IV: (CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1), Zellverband
aufgelockert, aber weitgehend erhalten, dilatierte Gehirnkapillare erkennbar (Pfeil)
4 Ergebnisse
91
4.2.5 Immunhistologie
Ziel des immunhistologischen Einsatzes des Primärantikörpers gegen das
Glucagon-like Peptide-1 war zum einen der Nachweis der Proteinsekretion der
verkapselten humanen Stammzellen innerhalb der ventrikulär implantierten
CellBeads® und damit die funktionelle Untersuchung der Implantate. Zum
anderen sollte ein Beweis der Proteinfreisetzung und damit der exogenen
zerebralen Zuführung des GLP-1 erbracht werden. Zu diesem Zweck wurden
bei jeweils 2 Tieren nach einer Implantationsdauer von 4 und 8 Wochen der
behandelten Versuchsgruppe IV eine immunhistologische Färbung
durchfgeführt. Zur Kontrolle wurde jeweils 1 Tier der Versuchsgruppe II (CCI)
und III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) immunhistologisch
ausgewertet. Dabei wurde innerhalb der Bewertung zwischen einer positiven
und negativen Immunreaktion gegenüber dem Status der Kontrolltiere
unterschieden.
Während alle 4 behandelten, untersuchten Tiere der Versuchsgruppe IV eine
deutlich positive Immunreaktion zeigten, war bei den 2 Kontrolltieren der
Versuchsgruppe II und III keine Immunreaktion erkennbar.
Im Rahmen der Auswertung konnte eine immunhistologisch positive Reaktion
der verkapselten Stammzellen innerhalb der implantierten CellBeads® mit Hilfe
einer deutlichen Anfärbung der Zellen und damit eine Sekretion des GLP-1
gezeigt werden. Desweiteren war innerhalb des rechten Seitenventrikels, in den
die Implantate verbracht wurden, eine immunhistologische Aktivierung der
Ventrikelwand und des Ependyms der Plexus choroidei als Zeichen einer
aktiven Aufnahme des Proteins nachweisbar. In der Umgebung des Ventrikels
und im Bereich des Stichkanales konnten GLP-1-immunpositive Makrophagen
gezeigt werden, die für einen Austritt des Proteins aus dem Ventrikelsystem
sprechen. In diesem Zusammenhang wurden außerdem immunpositive
4 Ergebnisse
92
Aggregate als Nachweis der exogenen Zuführung des GLP-1 im Bereich des
kontusionellen Gewebes aufgefunden.
Die Abbildungen 29 und 30 zeigen die Befunde der GLP-1-Färbung innerhalb
der CellBeads®, in Bereichen des Ventrikelsystems und des traumatisierten
Gewebes außerhalb der Implantate.
Anhand der Auswertung der Glucagon-like Peptide-1-Immunhistologie konnten
die Nachweise der Proteinkonzentration der verkapselten humanen
Stammzellen, eine Freisetzung und eine Diffusion des GLP-1 erbracht werden.
A
C
B
D
Abbildung 29
Histologische Darstellung der Befunde der ventrikulär implantierten
CellBeads® im Rahmen der GLP-1-Färbung
bei 100facher (A/B Messbalken 100 µm) und 400facher Vergrößerung
(C/D Messbalken 25 µm)
A/B: Immunpositive Aktivierung der Ventrikelwand nach 4 (A) und 8 Wochen (B),
(Pfeile)
C/D: Immunpositive Anfärbung der verkapselten GLP-1 sezernierenden
Stammzellen innerhalb der CellBeads® nach 4 (C) und 8 Wochen (D) (Pfeile)
4 Ergebnisse
A
93
B
C
Abbildung 30
Histologische Darstellung der Befunde der GLP-1-Färbung außerhalb
der Implantatebei 400facher Vergrößerung (A bis C Messbalken 25 µm)
A: GLP-1 immunpositive Makrophagen im Bereich der Ventrikelwand
und immunpositive Färbung des Ventrikelependyms des Plexus choroideus (Pfeile)
B: GLP-1 immunpositive Makrophagen an der Gehirnoberfläche im Bereich
des Stichkanals (Pfeile)
C: GLP-1 immunpositive Komplexe innerhalb des kontusionellen Gewebes (Pfeile)
4 Ergebnisse
94
Das Microtubule-associated Protein-1 als ein Bestandteil des zerebralen
Zytoskeletts wurde zur spezifischen Auswertung posttraumatisch geschädigter
intrazellulärer Strukturen eingesetzt.
Als Schwerpunkt der Untersuchung galt die Beurteilung der nach Verletzungen
des Zytoskeletts angefärbten Dendriten innerhalb des kontusionellen Kortex.
Die apikalen kortikalen Dendriten konnten anhand einer gesteigerten
Immunreaktion der longitudinalen Mikrotubuli dargestellt werden. Die
Graduierung der MAP-1-Färbung erfolgte im Vergleich zur Versuchsgruppe der
Kontrolltiere in eine positive Immunreaktion, mit einer hochregulierten
dendritischen Anfärbung und in eine negative Immunreaktion ohne Anfärbung
zytoskelettärer Strukturen. Für jedes Versuchstier wurden mindestens 3
Objektträger im Bereich der maximalen Traumaausprägung gefärbt und
lichtmikroskopisch ausgewertet. Die Ergebnisse wurden tabellarisch, graphisch
und anhand exemplarischer histologischer Aufnahmen beschrieben.
Innerhalb der Auswertung zeigten bis auf 2 Tiere der Gruppe II (CCI), 1 Tier der
Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads® ) und 3 Tiere der Gruppe IV
(CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1) alle Versuchstiere eine
immunpositive Reaktion mit einer hochregulierten Anfärbung der apikalen
Dendriten im Bereich der Kontusion. Die mit GLP-1 behandelten Tiere wiesen
meist dabei eine schwächere Ausprägung der Immunreaktion auf. Als Hinweise
einer Schädigung des Zytoskeletts wurde neben der Anfärbung der
mikrotubulären Anteile der Dendriten eine unterbrochene oder aufgelöste
Struktur der Dendriten und der Pyramidenzellen in der Lamina granularis
externa und Lamina pyramidalis externa beobachtet.
Die Ergebnisse der graduierten Auswertung der MAP-1-Färbung sind in der
Tabelle 6 und in den Abbildungen 31 und 32 einzusehen.
4 Ergebnisse
95
Tabelle 6: Übersicht der graduierten Auswertung der MAP-1-Färbung
Versuchsgruppen, Anzahl der Tiere mit entsprechender Immunreaktion
Versuchsgruppe
Positive Immunreaktion
Negative Immunreaktion
nach 4 Wochen
4 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe III
CCI und Implantation
leerer Cellbeads®
4 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
4 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe IV
GLP-1
sezernierender
Cellbeads®
5 von 5 Tieren
0 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
4 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
3 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
Gruppe II
CCI
Vergleich der Immunreaktion: MAP-1-Färbung
Tieranzahl
10
positiv
negativ
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CCI
CCI+leere CB
CCI+GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 31
Graphische Darstellung der Ergebnisse der MAP-1-Färbung
Y-Achse: Darstellung der Tieranzahl
X-Achse: Darstellung der Versuchsgruppen
positive Immunreaktion: Anfärbung der apikalen kortikalen Dendriten
negative Immunreaktion: keine Anfärbung des Zytoskeletts
Kontusionstrauma (CCI), CellBeads®(CB)
4 Ergebnisse
A
96
B
C
D
E
F
G
H
Abbildung 32
Histologische Darstellung der Befunde der MAP-1-Färbung bei 12,5facher
(A, Messbalken 800 µm)und 400facher Vergrößerung (B bis H, Messbalken 25 µm)
A/B: Kontrolltier nach 8 Wochen, negative Immunreaktion
C bis H: Versuchsgruppe II (CCI) nach 4 (C) und 8 Wochen(D),Versuchsgruppe III
(CCI und leere CellBeads®) nach 4 (E) und 8 Wochen (F),Versuchsgruppe IV (CCI und
CellBeads®mit GLP-1) nach 4 (G) und 8 Wochen (H), positive Immunreaktion (Pfeile)
4 Ergebnisse
97
Die spezifische Anfärbung des sauren Gliafaserproteins als ein Bestandteil des
Zytoskeletts ausgereifter Astrozyten diente der Beurteilung de- und
regenerativer Prozesse infolge des experimentellen Schädel-Hirn-Traumas. Die
Astrozyten als zur Makroglia gehörende Gliazellen wurden aufgrund ihrer
mechanischen
und
trophischen
Fähigkeiten,
insbesondere
unter
Berücksichtigung ihrer Befähigung zur reparativen Narbenbildung als Marker
der Schädigung des kontusionellen Gewebes herangezogen. Es wurden 3
Objektträger je Versuchstier mit Darstellung des maximalen Traumagrades mit
Hilfe einer semiquantitativen Graduierung in Schweregrade ausgewertet. Es
wurde eine geringe, fokal begrenzte Immunreaktion, eine moderate mit
zunehmender flächiger Anfärbung und eine massive Immunreaktion innerhalb
des traumatisierten Kortex und des Marklagers beschrieben, die durch eine
starke Zunahme und Vergrößerung der Gliazellen und Ausbildung einer
fibrösen Narbe gekennzeichnet war.
Der Hauptanteil der mit GLP-1 behandelten Tiere der Versuchsgruppe IV wies
mit einer Tieranzahl von 7 von 10 Tieren eine geringe Immunreaktion auf. Bei
den Versuchstieren der Gruppe II (CCI) konnte bei insgesamt 4 Tieren eine
moderat verstärkte Immunreaktion innerhalb der gesamten Kontusion ohne eine
Defektreparation beobachtet werden, während bei 5 der 10 Tiere die
Kontusionsverletzung mit einer gliären Narbenbildung verbunden war. Im
Rahmen der Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®)
zeigten 8 der insgesamt 10 Tiere eine überwiegend massive reparative
Hyperplasie und Hypertrophie der Astrozyten unter Bildung einer narbigen
Abgrenzung des Kontusionsdefektes. Die Astrozyten bildeten im Bereich der
lateralen Kontusionsgrenzzonen und des Marklagers entlang der
scherkraftbedingten Linien ein dichtes astrozytäres Faserwerk. Tendenziell
konnte eine geringgradige Abnahme der Immunreaktion im Vergleich von 4 und
8 Wochen beobachtet werden. Einen Einblick in die Ergebnisse geben die
Tabelle 7 und die Abbildungen 33 bis 35.
4 Ergebnisse
98
Tabelle 7: Übersicht der graduierten Auswertung der GFAP-Färbung
Versuchsgruppe
Geringe
Immunreaktion
Moderate
Immunreaktion
Massive
Immunreaktion
nach 4 Wochen
0 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
3 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe III
leerer Cellbeads®
1 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
0 von 5 Tieren
0 von 5 Tieren
5 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe IV
GLP-1 sezernierender
Cellbeads®
0 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
3 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
3 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
4 von 5 Tieren
0 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
Gruppe II
CCI
Vergleich der Schweregrade:GFAP-Färbung
Tieranzahl
10
massiv
moderat
gering
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CCI
CCI+leere CB
CCI+GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 33
Graphische Darstellung der Ergebnisse der GFAP-Färbung
Graduierung: massive, moderate und geringe Immunreaktion markiert
4 Ergebnisse
99
A
B
C
D
E
F
G
H
Abbildung 34
Histologische Darstellung der Befunde der GFAP-Färbung
bei 400facher Vergrößerung, Messbalken 25 µm
A-D: Versuchsgruppe II (CCI) nach 4 (A/B) und 8 Wochen (C/D)
E-H: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) nach 4 (E/F) und 8
Wochen (G/H) moderate (C/D, G/H) bis massive Immunreaktion (A/B, E/F)
4 Ergebnisse
100
A
B
C
D
Abbildung 35
Histologische Darstellung der Befunde der GFAP-Färbung
A-D: Versuchsgruppe IV (CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1) nach 4
(A/B) und 8 Wochen (C/D) geringe Immunreaktion
4 Ergebnisse
101
Zur spezifischen Färbung der zerebralen Abwehrmechanismen des Gehirns
infolge
der
kontusionellen
Verletzung
wurde
das
MHC
Typ
II
Oberflächenantigen auf der Mikroglia (OX6) selektiv angefärbt. Dabei konnten
die Hortegazellen als der Mikroglia angehörende residente Makrophagen des
zentralen Nervensystems dargestellt werden, die unter Antigen-Einfluß einer
Aktivierung unterliegen. Anhand einer semiquantitativen Analyse und
Kategorisierung in 3 Schweregrade wurden 3 Objektträger für jedes
Versuchstier beurteilt. Bei der Auswertung wurde der Kontusionskern, der
ventrale Kontusionsrand und das angrenzende Marklager berücksichtigt. Es
wurde dabei zwischen einer geringen, fokal begrenzten Immunreaktion mit
Anfärbung einzelner Hortegazellen über eine moderate, flächig verstärkte
Immunreaktion im Bereich des ventralen Kontusionsrandes und im Marklager
und einer massiven Immunreaktion unterschieden. Innerhalb der massiven
immunologischen mikrogliären Reaktion konnte eine starke Zunahme der
Hortegazellen im gesamten traumatisierten Kortex, bilateral im Marklager und
im lateralen Kontusionsbereich der Kraftlinien mit der Ausbildung von
Traumamarken nachgewiesen werden. Dabei zeigten 5 Tiere der Gruppe II
(CCI) und 7 Tiere der Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) eine
massive Steigerung der Immunreaktion. Bei dem Hauptanteil der mit GLP-1
behandelten Tiere wurden hingegen bei 6 Tieren nur eine geringe, vereinzelte,
lokale Akkumulation der Hortegazellen beobachtet.
Innerhalb der Untersuchung der zunehmenden Immunreaktion konnte ein
deutliches Muster beobachtet werden. Während bei den Tieren mit geringen
und moderaten Schweregraden die mikrogliäre Reaktion mit unterschiedlicher
Ausprägung auf den ventralen Kontusionsrand und das Marklager beschränkt
blieb, kam es bei der massiven Immunreaktion zur Mitbeteiligung des
kontusionellen Kortex und des contralateralen Marklagers. In der Tabelle 8 und
den Abbildungen 36 bis 38 sind die entsprechenden Befunde der OX6-Färbung
aufgeführt.
4 Ergebnisse
102
Tabelle 8: Übersicht der graduierten Auswertung der OX6-Färbung
Versuchsgruppe
Geringe
Immunreaktion
Moderate
Immunreaktion
Massive
Immunreaktion
nach 4 Wochen
1 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe III
leerer Cellbeads®
0 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
3 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
0 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
4 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
Gruppe IV
GLP-1 sezernierender
Cellbeads®
0 von 5 Tieren
2 von 5 Tieren
3 von 5 Tieren
nach 4 Wochen
3 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
nach 8 Wochen
3 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
1 von 5 Tieren
Gruppe II
CCI
Vergleich der Schweregrade: OX6-Färbung
Tieranzahl
10
massiv
moderat
gering
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CCI
CCI+leereCB
CCI+GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 36
Graphische Darstellung der Ergebnisse der OX6-Färbung
Graduierung: massive, moderate und geringe Immunreaktion markiert
4 Ergebnisse
103
A
B
C
D
E
F
G
H
Abbildung 37
Histologische Darstellung der Befunde der OX6-Färbung
A-D: Versuchsgruppe II (CCI) nach 4 (A/B) und 8 Wochen (C/D)
E-H: Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) nach 4 (E/F) und 8
Wochen (G/H) moderate (A/B) bis massive Immunreaktion (C bis H)
4 Ergebnisse
104
A
B
C
D
Abbildung 38
Histologische Darstellung der Befunde der OX6-Färbung
A-D: Versuchsgruppe IV (CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1)
nach 4 (A/B) und 8 Wochen (C/D), geringe Immunreaktion
4 Ergebnisse
105
4.2.6 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung
Die Untersuchungen der motorischen Leistung mit Hilfe des Beam Balance
Tests und des Beam Walking Tests und die Auswertung der kognitiven Leistung
mittels des Morris Water Maze Tests dienten der Beurteilung der
posttraumatischen motorischen Defizite und der Folgen des Kontusionstraumas
auf das Lernverhalten und das Gedächtnis der Tiere. Weiterhin sollte die
Wirksamkeit des Einsatzes des Glucagon-like Peptide-1 unter motorischen und
kognitiven Aspekten untersucht werden.
Die statistische Auswertung erfolgte anhand arithmetischer Mittelwerte der
einzelnen Versuchstage in Form von Gruppenvergleichen. Für jeden
Versuchstag wurden die Gruppenmittelwerte, Signifikanzen und Standardfehler
berechnet und graphisch dargestellt. Als Signifikanz wurde eine
Irrtumswahrscheinlichkeit mit einem Wert von p<0,05 festgelegt und
entsprechend mit einem Sternchen (*) innerhalb der graphischen Darstellung
gekennzeichnet. Die Mittelwerte der Messungen wurden in Säulen und deren
Standardfehler (SEM) wurden in Form von Fehlerbalken in die Graphen
eingebracht. Dabei wurden im Rahmen der Versuchsgruppenbezeichnungen
die CellBeads® mit CB abgekürzt. Die detaillierten Ergebnisse der statistischen
Untersuchung sind im Anhang aufgeführt.
4.2.6.1 Beam Balance Test
Bei der Verwendung des Beam Balance Tests wurde die Balancefähigkeit der
Tiere der verschiedenen Versuchsgruppen auf einem Balken im Vergleich zu
den gesunden Kontrolltieren 1 Tag vor und an den Tagen 1 bis 5 nach den
Eingriffen untersucht. Die Gruppenvergleiche erfolgten mit Hilfe der
gemessenen Verweilzeiten der Tiere auf der Versuchsapparatur. Dabei galt
eine Aufenthaltszeit von 60 Sekunden als Maximalwert.
Zu Beginn der Untersuchungen am Tag 1 vor den Operationen zeigten die
Tiere der Versuchsgruppe II (CCI) im Vergleich zur Gruppe I der Kontrolltiere
einen signifikant höhere Verweilzeit. Im Vergleich zu den übrigen
4 Ergebnisse
106
Versuchsgruppen waren keine Signifikanzen nachweisbar. Am Tag 1 nach den
Eingriffen konnte bei den Tieren der Gruppe II (CCI), der Gruppe III (CCI und
Implantation leerer CellBeads®) und der Gruppe IV der mit GLP-1 behandelten
Tiere eine signifikante postoperative Verschlechterung im Unterschied zur
Kontrollgruppe gezeigt werden. An den folgenden Tagen 2 bis 4 erwiesen sich
die Tiere der Versuchsgruppe III und IV sowohl als signifikant vermindert im
Vergleich zur Kontrollgruppe als auch an den Tagen 2 und 4 zur Gruppe II, bei
denen neben der Kontusionverletzung keine Implantation vorgenommen wurde.
Am letzten Tag (Tag 5) der Untersuchungen zeigten die Versuchstiere der
Gruppe II weiterhin signifikant verbesserte Verweilzeiten im Vergleich zur
Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) und zur Gruppe IV (CCI
und Implantation von CellBeads® mit GLP-1). Die Tiere der Gruppe III wiesen
außerdem eine Signifikanz zur Kontrollgruppe I auf. Bei den mit GLP-1
behandelten Tieren konnte allerdings am letzten Tag der Versuchsdurchführung
keine signifikanten Unterschiede mehr zur Kontrollgruppe beobachtet werden.
Die Auswertungen ergaben für die Tiere, bei denen ein Kontusionstrauma und
eine Implantation von leeren (Versuchsgruppe II), beziehungsweise CellBeads®
mit GLP-1 (Versuchsgruppe IV) vorgenommen wurde, eine signifikante
postoperative Verschlechterung der Verweilzeiten der Tiere am Tag 1 nach den
Operationen. Diese bestand für die gesamte Versuchsdauer.
Im Gegensatz dazu zeigten die Tiere, bei denen nur ein kontusionelles Trauma
induziert wurde (Versuchsgruppe II) ab dem Tag 2 nach den Eingriffen eine
signifikante Verlängerung der Verweilzeiten in Bezug zur Gruppe III und IV. Bei
der Betrachtung der Werte der mit GLP-1 behandelten Tiere zeichnete sich eine
deutliche Verbesserung der Werte ab dem Tag 4 nach den Operationen ab, an
dem sie keine signifikant verschlechterten Zeiten mehr zur Kontrollgruppe
aufwiesen. Im Folgenden sind die graphischen Darstellungen in den
Abbildungen 39 bis 41 der einzelnen Versuchstage und des gesamten
Versuchsablaufes über 5 Tage anhand des Vergleiches der Verweilzeiten in
Sekunden unter Bezugnahme der Versuchsgruppen einzusehen.
4 Ergebnisse
107
A
Vergleich der Verweilzeiten: Tag 1 vor OP
Verweilzeit [s]
50
45
*
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Vergleich der Verweilzeiten: Tag 1 nach OP
Verweilzeit [s]
50
45
40
35
30
25
20
*
*
*
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
Versuchsgruppen
C
Verweilzeit [s]
50
45
40
35
30
25
*
*
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 39
Beam Balance Test: Vergleich der Verweilzeiten in Sekunden
am Tag 1 vor und an den Tagen 1 bis 2 nach den Operationen,
Mittelwerte in Säulen, Standardfehler als Fehlerbalken dargestellt,
A/B: Signifikanzen (*) zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) dargestellt
C: Signifikante Unterschiede der Versuchsgruppen III (CCI+ leere CB) und IV
(CCI+ CB mit GLP-1 zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) und zur
Versuchsgruppe II (CCI) markiert (*)
4 Ergebnisse
108
A
Verweilzeit [s]
50
45
40
35
*
30
*
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Verweilzeit [s]
50
45
40
*
35
*
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
C
Verweilzeit [s]
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
*
*
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 40
an den Tagen 3 bis 5 nach den Operationen,
A/B: Signifikanten Versuchsgruppen zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle)
und zur Versuchsgruppe II (CCI) markiert (*)
C: Signifikante Unterschiede der Versuchsgruppen III und IV zur
Versuchsgruppe II (CCI) markiert (*), signifikanter Unterschied (*) zwischen der
Kontrollgruppe und der Gruppe III (CCI+leere CB), keine Signifikanz zwischen
der Kontrolle und Versuchsgruppe IV (CCI+GLP-1 CB)
4 Ergebnisse
109
Vergleich der Verweilzeiten: Tag 1 vor OP bis Tag 5 nach OP
Verweilzeit [s]
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+GLP-1 CB
60
50
40
30
20
10
0
Tag 1 vor
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5 Versuchstage
Abbildung 41
in der Übersicht am Tag 1 vor bis zum Tag 5 nach den Operationen,
Versuchsgruppe I (Kontrolle), Versuchsgruppe II (CCI), Versuchsgruppe III
(CCI und Implantation leerer CellBeads®) und Versuchsgruppe IV
(CCI und Implantation von CellBeads® mit GLP-1) markiert
4 Ergebnisse
110
4.2.6.2 Beam Walking Test
Anhand des Beam Walking Tests wurden in Ergänzung zu dem Beam Balance
Test die vestibulomotorischen Fähigkeiten der Tiere im Lauf beurteilt. Dabei
dienten die gemessenen Latenzzeiten in Sekunden zur Überquerung eines
Balkens zum Erreichen einer Zielbox als Untersuchungsparameter. Die
Untersuchungen wurden zeitgleich zu dem Beam Balance Test am Tag 1 vor
den Operationen und an den Tagen 1 bis 5 nach den Eingriffen durchgeführt.
Am Tag 1 vor den Operationen zeigten die Tiere der Versuchsgruppe IV die
signifikant kürzesten Latenzzeiten.
Im Rahmen der folgenden Untersuchungen konnten zwei zentrale Befunde
gestellt werden. Zum einen zeigten die Versuchstiere der Gruppe II (CCI) und
die Tiere der Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) während der
gesamten Versuchsdurchführung von Tag 1 bis zu dem Tag 5 nach den
Operationen signifikant größere Latenzzeiten im Gegensatz zu der Gruppe der
gesunden Kontrolltiere. Zum anderen wiesen sie an diesen Tagen außerdem
eine signifikante Verlängerung der Latenzzeiten im Vergleich zu den mit GLP-1
behandelten Tieren auf, die für eine verbesserte posttraumatische
Erholungszeit der behandelten Tiere spricht.
Vergleichend mit den Kontrolltieren konnte eine signifikante Verlängerung der
gemessenen Latenzzeiten bei den mit GLP-1 behandelten Tieren der
Versuchsgruppe IV an den Tagen 1, 2 und 4 nach den Eingriffen beobachtet
werden, die an den Tagen 3 und 5 nach den Operationen nicht bestand.
Die Ergebnisse der Einzeltage und des Gesamtverlaufes des Beam Walking
Testes sind anhand der Abbildungen 42 bis 44 graphisch dargestellt.
4 Ergebnisse
111
A
Vergleich der Latenzzeiten: Tag 1 vor OP
Latenzzeit [s]
20
15
*
10
*
*
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Vergleich der Latenzzeiten: Tag 1 nach OP
Latenzzeit [s]
20
*
*
15
*
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
C
Latenzzeit [s]
*
10
*
9
8
*
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 42
Beam Walking Test: Vergleich der Latenzzeiten in Sekunden
am Tag 1 vor und an den Tagen 1 bis 2 nach den Operationen,
A: Signifikanzen (*) zur Versuchsgruppe IV (CCI+ CB mit GLP-1) dargestellt
B: Signifikanzen (*) zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) dargestellt
C: Signifikanzen (*) zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) dargestellt,
Signifikanten Unterschiede der Versuchsgruppen II (CCI) und III (CCI+ leere CB) zur
Versuchsgruppe IV (CCI + CB mit GLP-1)
4 Ergebnisse
112
A
Latenzzeit [s]
10
9
8
*
*
CCI
CCI+leere CB
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Latenzzeit [s]
10
9
8
7
*
*
6
5
*
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
C
Vergleich der Latenzzeiten: Tag 5 post OP
Latenzzeit [s]
10
9
8
7
6
5
*
*
CCI
CCI+ leere CB
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 43
A/C: Signifikanzen (*) zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) und zur
Versuchsgruppe IV (CCI+ CB mit GLP-1) dargestellt
B: Signifikante Unterschiede zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) markiert (*)
4 Ergebnisse
113
Vergleich der Latenzzeiten: Tag 1 vor OP bis Tag 5 nach OP
Latenzzeit [s]
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+GLP-1 CB
20
15
10
5
0
Tag 1 vor
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
Versuchstage
Abbildung 44
in der Übersicht am Tag 1 vor bis zum Tag 5 nach den Operationen,
4 Ergebnisse
114
4.2.6.3 Morris Water Maze Test
Der Morris Water Maze Test diente der Untersuchung des Lernverhaltens und
des Gedächtnisses. Innerhalb der Versuchauswertung wurden die Latenzzeiten
in Sekunden zum Erreichen einer unterhalb der Wasseroberfläche
positionierten Plattform gemessen. Es wurden innerhalb der Durchführung der
Versuche unterschiedliche kognitive Aspekte berücksichtigt.
An den Tagen 14 bis 18 nach den entsprechenden Operationen wurde in einer
Aquisitionsphase das räumliche Lernvermögen untersucht.
Folgend am Tag 19 erfolgte eine Beurteilung des räumlichen Gedächtnisses,
nachdem die Plattform aus der Versuchsapparatur entfernt wurde.
Zum Abschluss der Untersuchungen wurde am Tag 20 und 21 zur Klärung
unspezifischer Dysfunktionen Versuche mit einer sichtbaren Plattform
durchgeführt.
Im Verlauf der gesamten Versuchsdurchführung waren bei den Tieren der
Versuchsgruppe II (CCI) und III (CCI und Implantation leerer CellBeads®)
signifikant verlängerte Latenzzeiten an den Tagen 14 bis 18 und 20 bis 21 nach
den Eingriffen, beziehungsweise deutlich verkürzte Aufenthaltszeiten innerhalb
der Spatial Probe an Tag 19 zu beobachten.
Die mit GLP-1 behandelten Versuchstiere der Gruppe IV zeigten hingegen mit
Ausnahme der Tage 16 und 19 nach den Operationen keine signifikanten
Verschlechterung der Latenzzeiten im Vergleich zur Kontrollgruppe.
An den Tagen 20 und 21 der Versuchsausführung mit einer sichtbaren
Plattform zeigten die behandelten Tiere außerdem im Vergleich mit der
Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) signifikant
verbesserte Latenzzeiten.
Die Ergebnisse der einzelnen Vesuchsabläufe und die gesamte
Lernentwicklung an den Tagen 14 bis 18 nach den Operationen in der
Übersicht sind in den Abbildungen 45 bis 48 aufgeführt.
4 Ergebnisse
115
A
Latenzzeit [s]
100
*
*
CCI
CCI+ leere CB
75
50
25
0
Kontrolle
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Latenzzeit [s]
*
40
*
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
C
Latenzzeit [s]
40
35
30
*
25
*
*
20
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 45
Morris Water Maze Test: Vergleich der Latenzzeiten in Sekunden
Tage 14,15,16: Versuche mit versteckter Plattform (Hidden Platform Version)
A-C: Signifikante Unterschiede zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) markiert (*)
4 Ergebnisse
116
A
Latenzzeit [s]
20
*
*
15
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Latenzzeit [s]
20
15
*
*
10
5
0
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
C
Verweilzeiten [s]
60
*
50
*
*
40
30
20
10
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
Abbildung 46
Morris Water Maze Test: Vergleich der Latenzzeiten (A/B) und Verweilzeiten (C)
in Sekunden an den Tagen 17 bis 19 nach den Operationen,
Tage 17,18: Versuche mit versteckter Plattform (Hidden Platform Version),
Tag 19: Versuche ohne Plattform (Spatial Probe)
A-C: Signifikante Unterschiede zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) markiert (*)
4 Ergebnisse
117
A
Latenzzeit [s]
10
*
*
CCI
CCI+ leere CB
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
CCI+ GLP-1 CB
Versuchsgruppen
B
Latenzzeit [s]
10
9
*
8
*
7
6
5
4
3
2
1
0
Kontrolle
CCI
CCI+ leere CB
Abbildung 47
an den Tagen 20 und 21 nach den Operationen,
Tage 20 und 21: Versuche mit sichtbarer Plattform (Visible Platform Version)
A/B: Signifikante Unterschiede zur gesunden Kontrollgruppe (Kontrolle) und
zwischen der Versuchsgruppe III (CCI+ leere CB) und der Versuchsgruppe IV
(CCI+ CB mit GLP-1) markiert (*)
4 Ergebnisse
118
Vergleich der Latenzzeiten: Tag 14 bis 18 nach OP
Latenzzeit [s]
Kontrolle
CCI
CCI+leere CB
CCI+GLP-1 CB
100
75
50
25
0
Tag 14
Tag 15
Tag 16
Tag 17
Tag 18 Versuchstage
Abbildung 48
in der Übersicht an den Tagen 14 bis 18 nach den Operationen innerhalb
der Versuche mit sichtbarer Plattform (Hidden Plattform Version) zur
Darstellung der Lernentwicklung, Versuche ohne Plattform (Spatial Probe)
und Versuche der sichtbaren Plattform (Visible Platform Version) dabei
aufgrund der abweichenden kognitiven Grundlage nicht berücksichtigt,
5 Diskussion
119
5 Diskussion
Mit der vorliegenden Arbeit sollte zum einen die zerebrale Biokompatibilität und
Immunisolation der eingesetzten Implantate festgestellt werden, zum anderen
dienten die Experimente der Untersuchung der Wirksamkeit Glucagon-like
Peptide-1 (GLP-1) sezernierender alginatverkapselter Stammzellen auf die
sekundären Folgezustände nach einem experimentellen Schädel-Hirn-Trauma.
Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Alginatkapseln (CellBeads®)
eine gute intrakranielle Stabilität und Bioverträglichkeit mit keinerlei
Nebenwirkungen am Implantationsort aufwiesen und aufgrund der sicheren
immunisolierenden Eigenschaften den zerebralen Einsatz verkapselter
humaner Stammzellen im Schädel-Hirn-Trauma-Modell der Ratte ermöglichten.
Innerhalb der Wirksamkeitsuntersuchung konnte eine Wirkstofffreisetzung des
GLP-1 in den Liquor nachgewiesen werden. Anhand histologischer,
immunhistologischer Auswertungen und mit Hilfe motorischer und kognitiver
Tests wurde das neuroprotektive Potential des GLP-1 bestätigt.
5.1 Diskussion Methodik
5.1.1 Tierexperimentelles Modell
Mit der vorliegenden Arbeit sollte der zerebrale Einsatz mesenchymaler
alginatverkapselter Stammzellen untersucht werden, die als neuroprotektives
Therapeutikum das Glucagon-like Peptide-1 freisetzten. Dabei wurde die
Wirksamkeit des GLP-1 bei der Behandlung sekundärer Folgeschäden nach
einem Schädel-Hirn-Trauma in einem etablierten Rattenmodell mit definierter
Gehirnverletzung überprüft.
Im Folgenden werden die angewendeten Operationsverfahren, Materialien und
die Methoden der Auswertung anhand bestehender Literatur erläutert.
5 Diskussion
120
5.1.1.1 Zerebrale Implantation von CellBeads®
In diversen Veröffentlichungen wurde Alginat eine gute Biokompatibiltät und
Immunisolierung sowohl im Zusammenhang mit einer intraperitonealen
(KULSENG et al. 1999) als auch nach intrazerebraler Verabreichung (READ et
al. 1999) zugeschrieben. Innerhalb klinischer Versuche wurde dessen Stabilität
und Verträglichkeit bewiesen (LAHAM et al. 1999; SOON-SHIONG et al. 1994).
Für eine Reihe von Erkrankungen wurden mit Hilfe der Mikroverkapselung mit
Alginat bereits therapeutische Heilversuche wie beispielsweise bei der
Behandlung von Diabetes mellitus (SOON-SHIONG et al.1994), zur
chronischen Schmerztherapie (JOSEPH et al.1994; BUCHSER et al.1996) und
zur Behandlung maligner Gehirntumore (BJERKVIG et al.2003; READ et al.
2001; VISTED u. LUND-JOHANSEN 2003) durchgeführt.
Aktuelle Publikationen konnten zudem den erfolgreichen Einsatz
alginatverkapselter Gewebe oder Stoffe im Rahmen einer neuroprotektiven
Therapie bei Morbus Huntington (BORLONGAN et al. 2004a), der
Parkinsonerkrankung (YASUHARA et al. 2005) und im Zusammenhang mit
einem Schlaganfall (BORLONGAN et al. 2004b) zeigen.
Vorteile der Verabreichung eines therapeutischen Proteins mit Hilfe
alginatverkapselter Stammzellen sind die minimal invasive, direkte
Verabreichungsmöglichkeit der Implantate, die Umgehung der Blut-HirnSchranke, die Erzielung hoher Wirkstoffkonzentrationen am Applikationsort und
die Möglichkeit einer ex-vivo gentherapeutische Behandlung ohne Eingriff in
das Patientengenom.
Innerhalb der Arbeit wurde neben der eigentlichen Wirksamkeitsuntersuchung
des Glucagon-like Peptide-1 bei einem Schädel-Hirn-Trauma eine
Biokompatibilitätsanalyse durchgeführt, bei der neben der Bioverträglichkeit die
Vitalität und Funktionsfähigkeit der Implantate überprüft wurde.
5 Diskussion
121
5.1.1.2 Experimentelles Schädel-Hirn-Trauma (CCI)
Zur experimentellen Induktion eines Schädel-Hirn-Traumas sind diverse
Modelle entwickelt und etabliert worden, die aufgrund der Heterogenität und
Komplexität der Erkrankung nicht das gesamte Spektrum des Krankheitsbildes
abdecken. Bei dem Einsatz eines tierexperimentellen Modelles sind bestimmte
Voraussetzungen nötig, um eine reproduzierbare, quantifizierbare und
kontrollierbare Untersuchung zu gewährleisten. Zum einen müssen die mit den
Tieren verbundenen Variabilitäten kontrolliert werden. Dies erfolgte mit Hilfe
standardisierter Zucht-, Haltungs- und Operationsbedingungen. Zum anderen
müssen die mechanischen Parameter des Modelles an sich klar definiert sein.
Im Rahmen der Untersuchungen fand das so genannte „Controlled Cortical
Impact“ (CCI) als ein bei Maus und Ratte etabliertes Kontusionsmodell
Anwendung (LIGHTHALL 1988, LIGHTHALL et al. 1989, LIGHTHALL et al.
1990; DIXON et al. 1991).
Mit Hilfe des Controlled Cortical Impact wurde eine unilaterale, kortikale und
moderate Kontusion erzeugt. Die Kontusion gilt dabei als ein wichtiger
klinischer Teilaspekt des Schädel-Hirn-Traumas, dessen Auswirkung und
Behandlungsmöglichkeit anhand des GLP-1 untersucht wurden.
Aufgrund der exakten Bestimmung der mechanischen Parameter durch die
Regulation der Schussgeschwindigkeit, der Eindringtiefe und der
Aufschlagsdauer konnte ein fokales, kontrollierbares und reproduzierbares
Verletzungsmuster erzielt werden.
Unberücksichtigt bleiben bei der Verwendung dieses Modelles dagegen
posttraumatische Hämatome, die epidural, subdural oder intraparenchymal
auftreten können und die als eine Hauptkomplikation einer Gehirnverletzung
anzusehen sind. Anhand der Operationstechnik entstanden durch die Vibration
des Diamantbohrers und durch Manipulation bei der Entfernung des
Knochendeckels bei der Kraniotomie zwar subdurale und subarachnoidale
Blutungen, die aber so geringgradig auftraten, dass sie keine klinische
Ausprägung simulieren können.
5 Diskussion
122
In diesem Zusammenhang wurden eine Reihe von Modellen entwickelt, die eine
klinisch nahe Bildung intrazerebraler Hämatome induzieren. Zum einen wurden
Hämatome durch eine Injektion von Kollagenase erzeugt (TANG et al.2004;
LEMA et al.2004), zum anderen wurden spezifisch subarachnoidale Blutungen
(SAH) durch eine Punktion zerebraler Arterien beschrieben (KUSAKA et al.
2004; OSTROWSKI et al.2005). In einem weiteren Ansatz wurden
intrazerebrale Hämatome durch die Injektion von Eigenblut erzeugt, bei der 100
µl Blut in das Gehirn injiziert wurden (NAKAMURA et al.2003).
5.1. 2 Untersuchungsmethoden
Die angewandten Analysesysteme sollten einen Vergleich zu publizierten
Methoden erlauben und einen Behandlungserfolg des Glucagon-like Peptide-1
feststellen.
5.1. 2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung
Die Bioverträglichkeit eines Stoffes ist unter anderem von der
Materialbeschaffenheit, dem Ort der Applikation und von der Zeitdauer der
Verabreichung abhängig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die
Implantate mit klar definierten und kontrollierten strukturellen Eigenschaften in
das Zentrale Nervensystem als immunologisch privilegiertes Organ verbracht.
Als Applikationsdauer wurden Zeiten von 4 und 8 Wochen festgelegt.
Grundsätzlich gibt es 3 Wege zur Beurteilung der Biokompatibilität. Es können
Anwendungen beim Menschen durchgeführt werden, die allerdings genaue und
für die Klinik relevante Ergebnisse voraussetzen und ethisch erst in einem weit
fortgeschrittenen Stadium der Untersuchung vertretbar sind. Außerdem
ermöglichen auch tierexperimentelle Versuche eine in-vivo Untersuchung
innerhalb eines intakten biologischen Systems. Von Nachteil ist hierbei, dass
die Ergebnisse nicht immer uneingeschränkt auf den Menschen übertragbar
sind. Vor dem Einsatz erfordern sie zudem eine tierschutzrechtliche Abwägung
der Unerlässlichkeit der Versuche und der ethischen Vertretbarkeit. Eine
5 Diskussion
123
weitere Möglichkeit ist die Untersuchung von Mechanismen außerhalb des
tierischen oder menschlichen Organismus mit in vitro kultivierten Zellen. Sie
stellt meist die erste Stufe bei der Charakterisierung der Biokompatibilität dar,
ist schnell durchführbar und reproduzierbar, ermöglicht jedoch oft keine exakte
Nachahmung der Prozesse innerhalb eines komplexen biologischen Systems.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde ein in-vitro Verfahren mit
tierexperimentellen Untersuchungen kombiniert. Während die gentechnische
Modifizierung der Stammzellen ex-vivo durchgeführt wurde, erfolgte die Analyse
der Biokompatibilität und die Wirksamkeitsuntersuchung des therapeutischen,
sezernierten Proteins mit Hilfe einer Implantation bei sowohl immundefizienten
als auch immunkompetenten Tieren.
5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma
In Publikationen verschiedener Autoren wurde im Rahmen einer Reihe von
Erkrankungen der therapeutische Einsatz des Glucagon-like Peptide-1
beschrieben. Der Hauptanteil der Veröffentlichungen befasste sich aufgrund der
inkretinen Wirkung des GLP-1 mit der Therapie von diabetischen Erkrankungen
und Veränderungen des Pankreas (DRUCKER 2001b; BRUBAKER u.
DRUCKER 2004). Weitere Untersuchungen umfassten den Einfluss des GLP-1
auf die Gewichtsregulation (TANG-CHRISTENSEN et al.1998; MEERAN et
al.1999), Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes (KINZIG et al.2002) und
dessen Wirkung auf das kardiovaskuläre System (BARRAGAN et al.1994;
BARRAGAN et al.1999; YAMAMOTO et al.2002).
Anhand von Publikationen wurde der GLP-1-Rezeptor unter anderem im
zerebralen Kortex und Ventrikelsystem (CALVO et al.1995; ALVAREZ et al.
1996) nachgewiesen und es konnte dessen Aktivierung im Zentralen
Nervensystem gezeigt werden (LARSEN et al.1997b).
Desweitern wurden neuroprotektive Effekte im Rahmen neuronaler
degenerativer Schädigungen (PERRY et al.2002a, PERRY et al.2002b, PERRY
u. GREIG 2003) und im Zusammenhang mit Gehirnverletzungen (CHOWEN et
5 Diskussion
124
al.1999) beschrieben. Mit Hilfe des GLP-1 konnte zudem eine Verbesserung
des Lernverhaltens und des Gedächtnisses bewiesen werden (DURING et al.
2003). Während GLP-1 in den genannten Untersuchungen in Form von
Injektionen und mit Hilfe von osmotischen Pumpen dem Gehirn zugeführt wurde
(DURING et al. 2003; PERRY et al. 2002c), erfolgte die Behandlung der Tiere
in der vorliegenden Arbeit anhand einer zerebralen Implantation GLP-1
sezernierender mesenchymaler alginatverkapselter Stammzellen. Anhand
dessen konnte eine dauerhafte, kontinuierliche Zuführung des Proteins
gewährleistet werden, die mit nur einem einmaligen operativen Eingriff für die
Versuchstiere verbunden war.
5.1.2.2.1 Histologie
Die histologische Auswertung erfolgte anhand fixierter Gefrierschnitte mit einer
Schnittdicke von 20 µm und mit Hilfe verschiedener Färbungen.
Eine Anfärbung der Zellkerne und die Erstellung von Übersichten des zu
analysierenden Gewebes durch die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) und die
Darstellung der Neuronenstruktur mit der Nissl-Färbung wurden entsprechend
der Literatur bezüglich experimenteller traumatischer Gehirnverletzungen
(DIXON et al.1999a; NAKAJIMA et al.2000) lichtmikroskopisch durchgeführt.
Die H.E.-Färbung ließ Aussagen über den allgemeinen morphologischen
Gewebeaufbau infolge des experimentellen Schädel-Hirn-Traumas und den
Nachweis der Implantate zu. Mit Hilfe der Nissl-Färbung wurde eine qualitative
Auswertung der kontusionell veränderten Neuronenstruktur durchgeführt.
Zur Beurteilung der implantierten CellBeads® wurde eine Schnittdicke von 20
µm gewählt. Dies war für die histologische Auswertung der Traumafolgen
nachteilig, da es bei dieser Schneidetechnik zu einer Überlagerung der
dargestellten zerebralen Strukturanteile kam, die eine semiquantitative Analyse
verhinderte. Im Gegensatz dazu zeigte sich die Schnittdicke innerhalb der
immunhistologischen Darstellung der Dendriten, Astrozyten und Hortegazellen
als vorteilhaft. Zur spezifischen Untersuchung der posttraumatischen,
5 Diskussion
125
insbesondere sekundärer Folgeschäden, wurden immunhistologische
Spezialfärbungen verwendet.
5.1.2.2.2 Immunhistologie
In Anlehnung an verschiedene Publikationen, die sich mit den Folgen eines
induzierten Schädel-Hirn-Traumas mit Hilfe des Controlled Cortical Impact
(CCI) befassten, wurden spezifische immunhistologische Färbungen eingesetzt.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit kamen Antikörper gegen das Glucagon-like
Peptide-1 (GLP-1), das Microtubule-associated Protein-1 (MAP-1), das Glial
fibrillary acidic Protein (GFAP) und das MHC Typ II Oberflächenantigen auf der
Mikroglia (OX6) zum Einsatz.
Die Verwendung des Primärantikörpers gegen GLP-1 diente dem Nachweis der
Wirkstoffsekretion und Proteinfreisetzung der Implantate und damit der
exogenen Zuführung des therapeutischen Stoffes. Desweiteren erfolgte eine
immunhistologische Auswertung der posttraumatischen zerebralen
Zytoskelettverletzungen mit Hilfe der Anfärbung des Microtubule-associated
Protein-1 (MAP-1). Diverse Veröffentlichungen konnten die posttraumatischen
Veränderungen der Axone und Dendriten, die infolge mechanischer Einwirkung
und Ionenverschiebungen entstehen, nachweisen. Infolge der Verletzungen
wurden Störungen des axonalen Transports und ein Verlust der Mikrotubuli
beschrieben, die anhand der MAP-1-Färbung sichtbar gemacht werden konnten
(CARBONELL u. GRADY 1999; POVLISHOCK 1986; CASTEJON
u.
ARISMENDI 2003).Als weitere Folgen einer traumatischen Gehirnverletzung
wurden eine reaktive Astrogliareaktion und eine vermehrte mikrogliäre
entzündliche
Zellaktivierung
gezeigt,
die
mit
Hilfe
etablierter
immunhistologischer Verfahren durch eine Anfärbung von GFAP und OX6
durchgeführt wurden (CORTEZ et al.1989, CSUKA et al.2000; KOSTULAS et
al.2002).
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels der Anfärbung des Gliafaserproteins
(GFAP) und des MHC Typ II auf der Mikroglia (OX6) die sekundären
5 Diskussion
126
Folgeschäden des Schädel-Hirn-Traumas in Form degenerativer und
entzündlicher Prozesse und damit die Behandlungseffekte des GLP-1
untersucht. Anhand dessen wurde eine Darstellung des reparativen Potentials
der Astrozyten mit Ausbildung einer fibrösen Glianarbe und die durch
Antigeneinfluss aktivierten mikrogliären Hortegazellen möglich.
5.1.2.2.3 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung
Zahlreiche Autoren befassten sich mit den neurologischen Dysfunktionen,
motorischen Ausfälle und den Defiziten des Lernverhaltens und des
Gedächtnisses, die nach einem Controlled Cortical Impact entstehen können
(DIXON et al. 1999b; KLINE et al. 2002; PRINS u. HOVDA 2001). Im Rahmen
der Veröffentlichungen wurden etablierte, spezielle motorische und kognitive
Untersuchungen durchgeführt, die in ihrem Aufbau und ihrer Ausführung auch
in der vorliegenden Abhandlung zum Einsatz kamen.
Zur zeitnahen Auswertung der vestibulomotorischen Fähigkeiten am Tag 1 vor
den Eingriffen und an den Tagen 1 bis 5 nach der Traumainduktion wurden der
Beam Balance Test und der Beam Walking Test verwendet. Sie dienten
innerhalb der Arbeit zur Beurteilung der Balancefähigkeit der Tiere im Stand
und im Lauf und wurden im Vergleich zu gesunden, traumatisierten und mit
GLP-1 behandelten Tieren betrachtet. Der frühe Untersuchungszeitpunktund
die kurze Versuchsdauer wurde in Anlehnung an bestehende Publikationen und
aufgrund der schnellen motorischen posttraumatischen Erholung der Tiere
durchgeführt.
Der Morris Water Maze Test kam als ein etabliertes Untersuchungsverfahren
des Lernverhaltens und des Gedächtnisses zum Einsatz. Er diente dem
Vergleich der Lernprozesse im Zusammenhang mit räumlichem Lernen an den
postoperativen Tagen 14 bis 18, einer Analyse des räumlichen Gedächtnisses
am Tag 19 und der Untersuchung des Lernverhaltens bei der Verwendung
einer sichtbaren Plattform an den Tagen 20 und 21 nach den Eingriffen.
Die statistische Auswertung wurde ähnlich zu DIXON et al. (2003) durchgeführt.
5 Diskussion
127
5.2 Diskussion Ergebnisse
Im nachfolgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der unterschiedlichen
Operations- und Auswertungsverfahren im Zusammenhang mit einem SchädelHirn-Trauma im Rahmen bestehender Publikationen diskutiert. Dabei soll die
Verkapselungstechnik mit ihrer zerebralen Biokompatibilität und Stabilität und
die Wirkstofffreisetzung und die Wirksamkeit der GLP-1 sezernierenden
Implantate auf die Schädigungen infolge des Kontusionstraumas im Vergleich
zur Kontrollgruppe gesunder Tiere, zur Gruppe der traumatisierten Tieren, bei
denen keine Implantation vorgenommen wurde und vergleichend zu Tieren,
denen neben einem Schädel-Hirn-Trauma Implantate ohne Zellen zerebral
verabreicht wurden, dargestellt werden.
5.2.1 Biokompatibilitätsuntersuchung
Die Analyse der Bioverträglichkeit der CellBeads®
beinhaltete eine
Untersuchung der Umgebungsreaktion auf die Implantate, der Stabilität der
Alginatkapsel und der Vitalität der verkapselten Zellen nach einer
Implantationsdauer von 8 Wochen mittels H.E.-gefärbter Gefrierschnitte.
Im Rahmen der Versuchsdurchführung wurden sowohl leere CellBeads® als
auch Implantate mit einer xenogenen Stammzelllinie einem immundefizienten
(RNU/Ztm) und einem immunkompetenten (BD IX/Ztm) Rattenstamm
intraparenchymal und intraventrikulär in das Gehirn verabreicht.
Bei der Beurteilung einer möglichen Abstoßungsreaktion wurden auch die
immundefizienten Tiere berücksichtigt, die zwar eine Thymusaplasie aufwiesen,
bei denen allerdings aufgrund der Beschränkung der Veränderungen auf den
Thymus, eine Antikörperreaktion nicht auszuschließen war.
Bei der Darstellung der Implantate innerhalb des Gehirngewebes wiesen die
leeren CellBeads® eine erhöhte Deformation des inneren, nur aus Goldpartikeln
bestehenden Cores auf, während sich der Zellcore der Implantate mit humanen
Stammzellen geformt und vollständig zeigte. Als Ursache ist eine größere
5 Diskussion
128
Stabilität des Cores durch die hohe Dichte der eingebetteten Stammzellen zu
sehen. Intraventrikulär war ein Verlust der Darstellbarkeit der Alginatkapsel und
des Zellcores durch die Schneidetechnik begründet. Das flüssigkeitsgefüllte
Ventrikelsystem erlaubte im Gegensatz zur intraparenchymalen Lage eine freie
Beweglichkeit der Implantate. Ein Beweis dafür ist die Lokalisation der
CellBeads®, die infolge des Schneideverfahrens verschoben wurden und meist
in Anlehnung an die Ventrikelwand und an die Plexus choroidei zu finden
waren.
In der Umgebung der Implantate konnten bei einigen Tieren gelbliche
Aggregate gefunden werden, die aufgrund ihrer Morphologie und durch das
zusätzliche Auftreten einzelner Erythrozyten als phagozytäre Abbauprodukte
des Hämoglobins als Hämosiderin angesprochen werden.
Um die Implantate bildete sich intraparenchymal eine epitheliale Zellschicht, die
sich durch eine zelluläre Einsprossung aus der ummittelbaren Umgebung ohne
Gliazellbeteiligung entwickelt hatte. Bei den immunkompetenten Tieren war
zusätzlich eine leichte Kapillaraktivierung mit geringgradiger Hyperämie der
Gefäße erkennbar, die auch in verschiedenen Publikationen beschrieben
wurde (JAEGER et al.1991).
In Anlehnung an bestehende Literatur waren sowohl bei den immundefizienten
als auch bei den immunkompetenten Versuchstieren keinerlei Anzeichen einer
Abstoßungsreaktion durch eine entzündliche Infiltration oder Fibrosierung als
Folge der Implantation nachweisbar (AEBISCHER et al.1988; BJERKVIG et al.
2003; READ et al.1999).
Zur Untersuchung der Stabilität der Alginatkapsel wurden humane Stammzellen
enthaltende CellBeads® aus dem Gehirngewebe entnommen und sowohl
morphologisch als auch funktionell untersucht.
Die Implantate zeigten strukturell eine intakte Alginatkapsel und einen
vollständigen Zellcore aus verkapselten Stammzellen, deren hohe Vitalität mit
Hilfe einer spezifischen Fluoreszenzfärbung nachgewiesen wurde.
5 Diskussion
129
Somit zeigte sich, dass die Implantate nach einer Langzeitimplantation von 8
Wochen eine sichere Immunabschirmung aufwiesen und die verkapselten
Zellen eine gute zerebrale Überlebensfähigkeit zeigten.
Im Rahmen der Biokompatibilitätsuntersuchung konnte das Zentrale
Nervensystem als ein idealer Ort für die Applikation von CellBeads® und für den
Einsatz verkapselter körperfremder Zellen gezeigt werden, deren
Immunisolation, Wirkstofffreisetzung und Versorgung durch die mit Hilfe der
Verkapselungtechnik mit Alginat gebildeten semipermeablen Membranen
sichergestellt wurde.
5.2.2 Untersuchung der Wirksamkeit des GLP-1 bei Schädel-Hirn-Trauma
Zur Prüfung der Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 auf die
posttraumatischen Schädigungen infolge einer moderaten, kontusionellen
Gehirnverletzung wurden die Wirkstofffreisetzung der CellBeads® in den Liquor,
die morphologischen Befunde nach der Traumainduktion und die
immunhistologischen Effekte des GLP-1 im Vergleich zu gesunden, und
traumatisierten, nicht behandelten Tieren untersucht. Grundlage der
beschriebenen Untersuchung ist die therapeutische Prävention vor sekundären
Folgeschäden des Schädel-Hirn-Traumas, während die primären Verletzungen
infolge mechanischer Einwirkungen nicht therapierbar sind.
5.2.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate
Histologisch untersucht wurden sowohl leere Implantate als auch CellBeads®
mit GLP-1 sezernierenden Stammzellen, die ventrikulär in den rechten
Seitenventrikel für eine Dauer von 4 und 8 Wochen verbracht wurden. Dabei
konnte ein Einfluss der Gefrierschneidetechnik und der Färbemethode auf die
Darstellbarkeit der Implantate beobachtet werden.
Aufgrund der Betrachtung verschiedener Schnittebenen durch einen CellBead®
konnte gezeigt werden, dass die Darstellung des inneren Zellcores von der
5 Diskussion
130
Schnittebene abhängig war. Da sich innerhalb der Implantate in jedem
CellBead® nur etwa 600 Zellen befanden, konnten diese je nach
Anschnittsebene mehr oder weniger vollständig gezeigt werden. Im Gegensatz
zu dem ungefärbten, nativen Zustand war nach der H.E.-Färbung ein
geringgradiger Darstellungsverlust der strukturellen Anteile der Implantate
nachweisbar.
5.2.2.2 Untersuchung der Proteinfreisetzung
Im Rahmen der Liquoruntersuchung konnte mit Hilfe eines GLP-1-spezifischen
ELISA bei den mit Glucagon-like Peptide-1 behandelten Tieren eine signifikante
Wirkstofffreisetzung des GLP-1 nach 4 und 8 Wochen nachgewiesen werden,
während die exemplarisch untersuchten Kontrollproben der Gruppe II (CCI) und
Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®) keine GLP-1-Konzentration
im Liquor zeigten.
Die Wirkstoffkonzentrationen lagen dabei nach 4 Wochen und 8 Wochen
zwischen 6,9 und 21,8 pM GLP-1. Während der durchschnittliche Wert nach 4
Wochen 17 pM betrug, wurde bei der Messung nach 8 Wochen eine geringere
mittlere Konzentration von 9,7 pM festgestellt, die möglicherweise mit einem
alterungsbedingten Funktionsverlust der verkapselten Stammzellen zu
begründen ist. Zu berücksichtigen ist dabei, dass anhand der Bestimmung der
Wiederfindungsrate bei Messungen der Liquorproben der gesunden Kontolltiere
von den 10 pM zugegebenem synthetischen GLP-1 lediglich 6,6 pM gemessen
wurden, so dass von deutlich höheren realen GLP-1-Konzentrationen
ausgegangen werden kann. Zur Beurteilung der therapeutischen Dosis konnten
Publikationen herangezogen werden, bei denen Behandlungen mit GLP-1 im
pM-Bereich durchgeführt wurden. Die Arbeiten zeigten einen therapeutische
Effekt im Konzentrationsbereich von 5 bis 30 pM. (FARILLA et al.2002;
DEACON et al.1998; KAVIANIPOUR et al.2003).
Anhand der Liquoranalyse konnte eine erfolgreiche Implantation mit
gleichmäßiger, kontiunierlicher Wirkstofffreisetzung des Glucagon-like Peptide-
5 Diskussion
131
1 nach 4 und 8 Wochen bewiesen werden, dessen Behandlungseffekte mit Hilfe
von sowohl histologischen und immunhistologischen als auch motorischen und
kognitiven Untersuchungen überprüft wurden. Diese Befunde können als
Belege für eine erfolgreiche, reproduzierbare Implantation und für eine sichere
Immmunisolation durch die Verkapselungstechnik angesehen werden.
5.2.2.3 Morphologische Befunde nach Trauma
Im Rahmen der Wirksamkeitsanalyse wurden zunächst die allgemeinen
morphologischen Veränderungen nach der induzierten Kontusionsverletzung
infolge des Controlled Cortical Impact untersucht. Dabei diente die
Befunderhebung innerhalb der qualitativen Auswertung mit Hilfe der H.E.- und
Nissl-Färbung der Beurteilung der posttraumatischen Folgeschäden und der
Etablierung des Traumamodelles. Desweiteren wurde eine semiquantitative
immunhistologische Analyse unter spezifischen Aspekten durchgeführt.
5.2.2.3.1 H.E.-Färbung
Bei allen traumatisierten Versuchstieren konnte im Bereich der Kontusion eine
kortikale Gehirnschwellung beobachtet werden, die bei den mit GLP-1
behandelten Tieren deutlich verringert war. Als Ursache der Gliazellschwellung
sind
Schädigungen
der
Makroglia
und
Veränderungen
der
Ionenkonzentrationen zu nennen, die ein intrakontusionelles und perifokales
Hirnödem bewirken. Man unterscheidet in diesem Zusammenhang zwischen
einem extrazellulären, durch die Störung der Blut-Hirn-Schranke bedingten
vaskulären Ödem und einer ödematösen Veränderung intrazellulärer,
zytotoxischer Art, die gemeinsam ursächlich an der Bildung einer ödematösen
Schwellung des zerebralen Gewebes beteiligt sind (KLATZO 1967). In diversen
Veröffentlichungen wurden die Mechanismen der Schädigungen infolge einer
traumatischen Gehirnverletzung anhand von Beschreibungen der Störung der
Blut-Hirn-Schranke (BASKAJA et al.1997), exzitotoxischen Vorgängen
(PALMER
et
al.1993)
und
ischämisch
bedingten
zerebralen
5 Diskussion
132
Zirkulationsstörungen (BOUMA et al.1991; BRYAN et al.1995) aufgezeigt.
Zahlreiche Autoren beschrieben zudem Gehirnschwellungen, die neben
ödematösen Ursachen auch durch die Bildung eines posttraumatischen
Hydrozephalus entstanden und durch einen Verdrängungseffekt mit einer
atrophischen Abnahme der Kortexdicke verbunden waren (MAZZINI et al.2003;
GUYOT et al.2000; MARMAROU et al.1996). Diese traumatisch bedingten
Ventrikelerweiterungen durch Störungen der Liquorregulation und kortikalen
Atrophien waren in der vorliegenden Arbeit neben der Versuchsgruppe II (CCI)
in hohem Maße bei der Versuchsgruppe III (CCI und Implantation leerer
CellBeads®) zu beobachten, die sich durch die zusätzlich traumatisierende
Implantation begründen lässt.
In Anlehnung an diverse Publikationen konnten bei 2 Versuchstieren der
Gruppe III als Nebenbefund der moderaten Verletzungen hochgradige kortikale
Nekrosen und Gewebeverluste des parietalen Kortex gezeigt werden. Im
Gegensatz dazu stellten innerhalb von Untersuchungen schwerer
Gehirnschädigungen mit Hilfe des Controlled Cortical Impact cavitäre
Kortexverluste im Rahmen kürzerer Versuchsabläufe einen zentralen Befund
dar (PALMER et al.1993; DIXON et al.1999).
5.2.2.3.2 Nissl-Färbung
Mit Hilfe der Nissl-Färbung wurden die posttraumatischen neuronalen
Schädigungen infolge der moderaten Gehirnverletzung unter Berücksichtigung
der allgemeinen Zellarchitektonik und der pyramidalen Zellstrukturen
untersucht. Als Hauptbefund wurde besonders bei den kontusionell
traumatisierten Tieren der Versuchsgruppe II eine starke Abnahme der
neuronalen Zelldichte beobachtet. Weiterhin zeigten vermehrt die Versuchstiere
der Gruppe III, bei denen neben der Kontusion leere Implantate verabreicht
wurden, eine starke ödematöse Auflösung des Zellverbandes und einen
verstärkten neuronalen Zellverlust. Im Gegensatz dazu waren bei den mit GLP-
5 Diskussion
133
1 behandelten Tieren sowohl der Zellverband und die Neuronendichte
weitgehend erhalten als auch ein deutlich verminderte Zellverlust nachweisbar.
Neuronale Degeneration, Zellverluste und ödematöse Störungen des kortikalen
Zellverbandes stellen infolge von traumatischen Gehirnschädigungen einen
bekannten pathophysiologischen Mechanismus dar (ASANO et al.1989;
KONTOS u. POVLISHOCK 1986; HALLAM et al.2004; FARBER 1990).
Die Unterscheidung der Art der Veränderungen in ein extrazelluläres Ödem im
perivaskulären Raum oder in eine intrazelluläre ödematöse Ausprägung im
Neuropil mit Ausbildung eines Status spongiosus konnte lichtmikroskopisch
nicht durchgeführt werden, da zur Darstellung des Neuropils eine
elektronenmikroskopische Untersuchung erforderlich gewesen wäre.
Anhand der morphologischen Untersuchung konnte mit Hilfe der gestellten
Befunde in der H.E.- und Nissl-Färbung der Beweis der reproduzierbaren
Traumainduktion und die Etablierung des eingesetzten Kontusionsmodelles
erbracht werden. Die histologische Auswertung zeigte zudem verminderte
zerebrale posttraumatische Schädigungen bei den behandelten Tieren.
5.2.2.4 Immunhistologie
Innerhalb der immunhistologischen Auswertung kamen 4 Antikörper zum
Einsatz. Zur Klärung spezifischer Fragestellungen wurden Antikörper gegen das
Glucagon-like Peptide-1(GLP-1), das Microtubule-associated Protein-1 (MAP1), das Glial fibrillary acidic Protein (GFAP) und gegen das MHC Typ II
Oberflächenantigen auf der Mikroglia (OX6) verwendet.
Mit Hilfe des Antikörpers gegen GLP-1 konnte die Wirkstoffproduktion und
Freisetzung des Proteins durch die ventrikulär implantierten CellBeads® gezeigt
werden. Außerdem diente die immunhistologische Färbung dem Nachweis der
Diffusion des therapeutischen GLP-1 aus dem Ventrikelsystem in das
kontusionelle kortikale Gewebe. Bei lichtmikroskopischer Betrachtung waren bei
allen 4 exemplarisch gefärbten Gewebeproben mit GLP-1 sezernierenden
Implantaten eine immunhistologische Anfärbung der verkapselten Stammzellen
5 Diskussion
134
feststellbar. Als wichtiger Befund wurde eine immunpositive Reaktion der
Ventrikelwand und der Ependymzellen der Plexus choroidei nach 4 und 8
Wochen festgestellt, die aufgrund der nachgewiesenen GLP-1-Rezeptoren in
diesen Bereichen (CALVO et al.1995; ALVAREZ et al.1996) für eine Aufnahme
und eine Passage des sezernierten Proteins
sprechen. In diesem
Zusammenhang konnte das GLP-1 auch innerhalb des kontusionellen
kortikalen Gewebes nachgewiesen werden. Eine weitere Beobachtung war ein
immunologischer Nachweis des GLP-1 an der Gehirnoberfläche im Bereich des
Stichkanals, der möglicherweise für einen direkten Austritt des Proteins aus
dem Stichkanal spricht.
Diese Befunde zeigten die Wirkstoffsekretion der CellBeads® nach einer
Implantationsdauer von 4 und 8 Wochen. Die zur Kontrolle immunhistologisch
untersuchten Tiere der Gruppe II (CCI) und Gruppe III (CCI und Implantation
leerer CellBeads®) zeigten hingegen keinerlei zerebrale Immunreaktion.
Bei der Beurteilung der Zytoskelettverletzungen wurde bei den nicht
behandelten Tieren eine hochregulierte, positive immunhistologische Anfärbung
des MAP-1 gezeigt, die sich bei den mit GLP-1 behandelten Tieren in ihrer
Ausprägung vermindert darstellte. Anhand bestehender Literatur lässt sich
dieser Befund durch die starke Sensitivität des Microtubule-associated Protein1 und die hohe Labilität der Mikrotubuli erklären (CARBONELL u. GRADY
1999; CASTEJON u. ARISMENDI 2003). Mit der immunhistologischen
Darstellung der Astrozyten mit Hilfe des GFAP und die Anfärbung der
mikrogliären Hortegazellen anhand des OX6 konnten neuroprotektive Effekte
des GLP-1 nachgewiesen werden. Posttraumatisch zeigten die Versuchstiere
der Gruppe II (CCI) und Gruppe III (CCI und Implantation leerer CellBeads®)
eine moderate bis massive Steigerung der makro- und mikrogliären Reaktion,
die
auch
in
zahlreichen
Publikationen
bezüglich
traumatischer
Gehirnverletzungen beschrieben wurde (CORTEZ et al.1989; KOSTULAS et
al.2002). Auffallend war die deutlichste Immunreaktion bei den Tieren, bei
denen neben der Induktion des Kontusionstraumas eine Verabreichung leerer
Implantate vorgenommen wurde (Versuchsgruppe III). Als Zeichen eines
5 Diskussion
135
ausgeprägten Traumas wurden astrozytäre Glianarben und eine massiv
gesteigerte Anzahl mikrogliärer Hortegazellen beobachtet, die zudem auch
contralateral zur Traumaseite nachzuweisen war. Hierfür ist die zusätzliche
Traumatisierung durch die stereotaktische Implantation zu vermuten. Außerdem
stellen die implantierten CellBeads® eine weitere intrakranielle Raumforderung
dar. Die Ausprägung der Immunreaktion war dabei in hohem Maße im Bereich
der Kraftlinien festzustellen, die durch die posttraumatischen Scherkräfte
verursacht wurden. Infolge des Ausbildungsprozesses der reparativen
Narbenbildung war tendenziell eine Abnahme der immunhistologischen GFAPFärbung nach 8 Wochen nachweisbar.
Im Gegensatz zu den unbehandelten Tieren konnte bei den Tieren mit
implantierten GLP-1 sezernierenden verkapselten Stammzellen nach 4 und 8
Wochen sowohl eine deutlich Abnahme der reaktiven Astrozyten als auch der
aktivierten
Hortegazellen
beobachtet
werden,
die
für
die
hirnfunktionsschützende Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 vor
sekundären posttraumatischen Folgeschäden spricht.
5.2.2.5 Untersuchung der motorischen und kognitiven Leistung
Im Rahmen der Beurteilung der posttraumatischen motorischen und kognitiven
Folgeschäden kamen zum einen der Beam Balance Test und Beam Walking
Test an den Tagen 1 vor den Operationen und postoperativ an den Tagen 1 bis
5 zum Einsatz, zum anderen erfolgte eine Untersuchung des Lernverhaltens an
den Tagen 14 bis 21 nach den Eingriffen mit Hilfe des Morris Water Maze
Tests. Während der Beam Balance Test und Beam Walking Test eine Analyse
der posttraumatischen vestibulomotorischen Fähigkeiten im Stand und Lauf
ermöglichten, diente der Morris Water Maze Test der Bewertung verschiedener
Aspekte des Lernverhaltens. Dabei konnte in der Aquisitionsphase an den
Tagen 14 bis 18 die Verkürzung der Latenzzeit und eine Verminderung der
Fehlversuche als Hinweis auf das Niveau des Lernprozesses gesehen werden.
Die Spatial Probe an Tag 19 post OP spiegelte die Gedächtnisleistung aus der
5 Diskussion
136
zuvor durchgeführten Aquisitionsphase wieder. Die Versuche am Tag 20 und
21 nach den Eingriffen mit der sichtbaren Plattform ermöglichten den
Ausschluss allgemeiner Dysfunktionen der Tiere.
Im Vergleich zur bestehenden Literatur waren prinzipiell im Rahmen der
vorliegenden Arbeit sowohl deutlich verbesserte Untersuchungszeiten und
Lernprozesse als auch kürzere postoperative Erholungszeiten erkennbar, die
durch den geringeren Schweregrad des Schädel-Hirn-Traumas innerhalb der
vorliegenden Abhandlung verursacht wurden (DIXON et al.1999a; KLINE et al.
2002; DIXON et al.2003).
Innerhalb der Auswertung zeigten die traumatisierten Tiere im Vergleich zur
gesunden Kontrollgruppe in der Versuchsdurchführung postoperativ allgemein
verminderte Untersuchungswerte, so dass von einer erfolgreichen Etablierung
der Testverfahren ausgegangen werden kann.
In Bezug zur Wirksamkeit des GLP-1 konnte anhand des Beam Walking Tests
eine verkürzte posttraumatische Erholungszeit und signifikant verbesserte
Latenzzeiten vergleichend zu den unbehandelten Tieren nachgewiesen werden.
Dieser Befund war tendenziell mit Hilfe des Morris Water Maze Tests zu
bestätigen, da die behandelten Tiere im Gegensatz zur Gruppe II und III zum
einen, außer an den Tagen 16 und 19, keine signifikante Verschlechterung zur
gesunden Kontrollgruppe zeigten, zum anderen konnten an den Tagen 20 und
21 signifikant verbesserte Werte zur Versuchsgruppe III beobachtet werden.
Bei allen Tieren war infolge der Traumainduktion eine verminderte räumliche
Gedächtnisleistung postoperativ am Tag 19 nachweisbar.
Als
Ursache
dieses
lediglich
tendenziellen
Nachweises
des
Behandlungserfolges durch das Glucagon-like Peptide-1 innerhalb des Morris
Water Maze Tests sind die komplexe Untersuchungsmethode und die geringe
Stichprobenanzahl zu nennen.
In der vorliegenden Arbeit waren der Beam Balance Test und Beam Walking
Test nicht zielführend, da der Testzeitpunkt als zu früh anzusehen ist, um
therapeutischer Effekte des GLP-1 zu erkennen und zu beweisen.
5 Diskussion
137
Kritisch zu hinterfragen sind die Ergebnisse, die im Rahmen des Beam Balance
Test aufgestellt wurden. Die Versuchstiere der Gruppe II (CCI) wiesen dabei
verbesserte Versuchswerte als die Tiere der Gruppe III (CCI und Implantation
leerer CellBeads®) und der mit GLP-1 behandelten Tiere der Gruppe IV auf. Als
Gründe sind zum einen die im Gegensatz zu dem Beam Walking Test
notwendige Motivation der Tiere zur Versuchsdurchführung zu nennen, zum
anderen
waren
die
Beobachtungen
durch
die
undifferenzierten
Untersuchungsparameter begründet. Vergleichend zu den Tieren der Gruppe II
zeigten die Tiere der Versuchsgruppe III und insbesondere der mit GLP-1
behandelten Gruppe IV innerhalb der Testausführung eine starke Tendenz zu
einem aktiven Verlassen der Apparatur, die mit kürzeren Versuchswerten
verbunden war und innerhalb der Auswertung nicht berücksichtigt wurde.
5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung
Die in der vorliegenden Untersuchung nachgewiesene neuroprotektive
Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 mit Hilfe GLP-1 sezernierender
alginatverkapselter Stammzellen könnte bei der Behandlung einer
kontusionellen Gehirnverletzung zur klinischen Anwendung kommen, allerdings
unter Voraussetzung nachfolgender Versuche. Weitere Prüfungen des
Langzeitverhaltens der alginatverkapselten GLP-1 sezernierenden Stammzellen
müssten in diesem Zusammenhang über mehrere Monate mit einer größeren
Tieranzahl durchgeführt werden, um eine detailliertere Untersuchung der
histologischen Wirkungen und der Effekte bezüglich des Lernverhaltens und
des Gedächtnisses zu erzielen. Dabei wäre es sinnvoll den Schweregrad und
die Art des experimentellen Traumamodelles zu variieren, um weitere klinische
Aspekte traumatischer Gehirnverletzungen zu untersuchen.
Die
vorliegende
Untersuchung
zeigte
den
erfolgreichen
Einsatz
alginatverkapselter mesenchymaler humaner Stammzellen und die
neuroprotektive Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 bei der Behandlung
eines experimentellen, fokalen kontusionellen Schädel-Hirn-Traumas.
6 Zusammenfassung
138
6 Zusammenfassung
Pia Rittmann
GLP-1 sezernierende mesenchymale alginatverkapselte Stammzellen zur
Neuroprotektion nach Schädel-Hirn-Trauma
Das Schädel-Hirn-Trauma tritt häufig als Folge von Verkehrsunfällen bei
Mensch und Tier auf und ist anhand einer hohen Defektheilung mit einer meist
lebenslangen Behinderungen der Patienten verbunden. Aufgrund eines
fehlenden verfügbaren Therapeutikums zur Behandlung sekundärer
posttraumatischer Folgeschäden, werden die komplexen Gehirnverletzungen
bis heute nur symptomatisch behandelt.
Ein neuer Therapieansatz ist eine direkte zerebrale Implantation gentechnisch
modifizierter Stammzellen, die mit Alginat verkapselt, neuroprotektive
Therapeutika freisetzen. Alginat hat sich dabei mit seiner Fähigkeit zur Bildung
semipermeabler, immunisolierender Membranen als sehr geeignet erwiesen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der intrakraniellen
Biokompatibilität des Alginates und der Vitalität der verkapselten Stammzellen.
Zudem sollte die Wirksamkeit des Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), welches
nach ventrikulärer Implantation von alginatverkapselten humanen
mesenchymalen Stammzellen sezerniert wurde, auf die sekundären
Folgeschäden eines experimentell induzierten, moderaten Schädel-HirnTraumas überprüft werden.
Im Rahmen der Biokompatibiltätsuntersuchung wurden sowohl Implantate ohne
Zellen als auch mit einer xenogenen Stammzelllinie bei einem immundefizienten
und einem immunkompetenten Rattenstamm zerebral verabreicht. Anhand
histologischer, morphologischer und funktioneller Auswertungen wurden die
gewebliche Abstoßungsreaktion und die Vitalität der verkapselten Stammzellen
untersucht. Zur Analyse der Wirksamkeit des GLP-1 nach einem Schädel-HirnTrauma
wurden
bei
den
Versuchstieren
eine
moderate,
fokale
Kontusionsverletzung mit Hilfe des „Controlled Cortical Impact“ erzeugt und
6 Zusammenfassung
139
dessen Auswirkungen ohne Implantation und mit sowohl leeren als auch GLP-1
sezernierenden Implantaten überprüft. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe
histologischer, immunhistologischer Verfahren und anhand motorischer (Beam
Balance Test, Beam Walking Test) und kognitiver Tests (Morris Water Maze
Test). Bei der Beurteilung der posttraumatischen Schädigungen wurden
allgemeine
histologische
Veränderungen,
Zytoskelettverletzungen,
degenerative und entzündliche Prozesse immunhistologisch mit 4 Antikörpern
untersucht (Glucagon-like Peptide-1, Microtubule-associated Protein-1,
Gliafaserprotein und mikrogliäres MHC Typ II Oberflächenantigen OX6).
Anhand der Biokompatibilitätsuntersuchung konnte gezeigt werden, dass die
Implantate nach einer Versuchsdauer von 8 Wochen sowohl bei
immundefizienten als auch bei immunkompetenten Tieren einer sicheren
Immunabschirmung
unterlagen,
zu
keinerlei
Nebenwirkungen
am
Implantationsort in Form einer Abstoßungsreaktion führten und dass die
verkapselten Zellen nach der Implantation vital und funktionsfähig waren.
Im Rahmen der Beurteilung der Wirksamkeit konnten nach einer
Versuchsdauer von 4 und 8 Wochen eine signifikante Wirkstofffreisetzung und
neuroprotektive Effekte des GLP-1 durch eine Verminderung der
Neuronenverluste, eine verringerte Ausprägung der Zytoskelettverletzungen,
eine Abnahme der astrozytären Gliareaktion und eine reduzierte
Mikrogliaaktivierung gezeigt werden. Anhand der motorischen und kognitiven
Untersuchungen ließen sich bei den mit GLP-1 behandelten Tieren signifikant
verkürzte motorische posttraumatische Erholungszeiten nachweisen, die
tendenziell auch bei der Beurteilung des Lernverhaltens und des Gedächtnisses
zu sehen waren.
Die durchgeführten Untersuchungen bestätigten den erfolgreichen Einsatz
alginatverkapselter Stammzellen und das neuroprotektive Potential des GLP-1
als Therapeutikum zur Behandlung sekundärer Folgeschäden, die nach einem
Schädel-Hirn-Trauma entstehen.
7 Summary
140
7 Summary
Pia Rittmann
GLP-1 secreting mesenchymal alginate-encapsulated stem cells for
neuroprotection after traumatic brain injury in rats
Traumatic brain injuries often occur after accidents in humans and animals. In
many cases, the patients suffer life-long, permanent disabilities due to strong
defect healing. Because of the lack of therapeutic approaches for treatment of
secondary posttraumatic consequential injuries, until today complex brain
injuries mostly to be treated solely symptomatically.
A new concept of treatment is the direct cerebral implantation of genetically
modified stem cells, which encapsulated in alginate continually set free
neuroprotective therapeutica. Alginate has proven well suited for this task due
to its ability to form semipermeable, immunoisolating membranes.
Target of the paper at hand is the investigation of intracranial biocompatibility of
the alginate and the vitality of the encapsulated cells. Additionally, the
effectiveness of the glucagon-like peptide-1 (GLP-1), which is secreted from
alginate encapsulated human mesenchymal stem cells, was tested for
treatment of the secondary posttraumatic injuries caused by a experimentally
induced, moderate traumatic brain injury.
In the context of the biocompatibilty testing, both implants without cells and with
xenogen stem celllines were implanted into the brain of immunodeficient, as
well as immunocompetent rats. The possible host versus graft reaction and the
vitality of the encapsulated stem cells were tested based on histological,
morphological and functional methods.
For analyzation of the effectiveness of GLP-1 after a traumatic brain injury, a
moderate, focal brain contusion was induced by means of the "controlled
cortical impact" practise and afterwards two animal groups were investigated
compared with and without GLP-1 secreting implants.
7 Summary
141
The evaluation was conducted by the means of histological and
immunohistological, as well as motoric (Beam Balance Test, Beam Walking
Test) and cognitive (Morris Water Maze) tests.
Histological examination includes investigations of cytoskeleton injuries,
degenerative and inflammatory processes immunohistologically with 4
antibodies (glucagon-like peptide-1, microtubule-associated protein-1, glial
fibrillary acidic protein and MHC Type II surface antigene OX6).
The biocompatibility evaluation showed that after 8 weeks in vivo the implants
were subject to a secure immunoshielding both in immunodeficiant and
immunocompetent animals. Additionally no host versus graft reaction could be
determined at the place of implantation and the encapsulated cells remained
vital and functioning after the implantation.
In judging the therapeutic effectiveness it could be shown that after 4 and 8
weeks there was a release of active substance. Neuroprotective effects of the
GLP-1 were shown by a reduction of neurone loss, decreased cytoskeleton
injuries, a reduction of astrocytal glial reactions and a reduced microglial
activation.
Based on motoric and cognitive tests, the GLP-1 treated animals showed a
significant shorter motoric posttraumatic recovery time that can be judged as a
tendancy learning characteristics and the memory of the animals.
The conducted tests proved the successful used of alginate encapsulated stem
cells and the neuroprotective potential of GLP-1 as a therapeutic system for
treatment of secondary injuries after traumatic brain injuries.
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9 Anhang
162
9 Anhang
9.1 Bezugsquellen
9.1.1 Versuchstiere
Rattenstamm
Anzahl Tiere
Bezugsquelle
Zentrales
RNU/Ztm
12
(rnu/rnu)
Tierlaboratorium der
Medizinischen
Hochschule Hannover
Zentrales
BD IX/Ztm
12
Medizinischen
Hochschule Hannover
Zentrales
Sprague-Dawley/Ztm
39
(SPRD/Ztm)
Medizinischen
Hochschule Hannover
9.1.2 OP-Bedarf
Material
Bezugsquelle
Mikroliterspritze 10 µl und 50 µl
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,
Switzerland
Mikroliterkanülen 6/pk, stumpf
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,
Switzerland
TC- Plate 6 well Cellstar®, No. 657160
Greiner-bio-one, Frickenhausen
BD Falcon Cellstrainer, 100 µm Nylon,
Bioscience, Erembodegem,
352360
Belgien
9 Anhang
163
Centrifuge Tubes 50 ml
Labcon, San Rafael,
USA
Kanülen 100 Sterican Gr. 17,
B. Braun, Melsungen
0,5 x 25 mm
Braun Omnifix-F Einmalspritzen 1ml
B. Braun, Melsungen
Feather-Skalpellklingen Nr. 10
Produkte für Medizin GmbH, Köln
Einmalhandschuhe: Kimberly Clark
Kimberly Clark, Zaventem,
Powder Free Latex Exam Gloves
Belgien
Mini-Bulldog-Klemmen 35 mm
Aesculap AG und Co. KG, Tuttlingen
Nahtmaterial:
Ethicon, Norderstedt
4/0 Ethilon, monofil, (Polyamid 6)
Desowasch® Händereinigungsmittel
Desomed AG, Freiburg
Aseptoman® Händedesinfektionsmittel
Cutasept® F Hautdesinfektionsmittel,
Bode Chemie, Hamburg
No. 382
Desomed Rapid AF,
Oberflächendesinfektionsmittel 022770
Perfusionsbesteck mit Flügel, 21 GA,
Becton Dickinson Sytems, Utah,
0,8 x 20 mm
USA
Einmalrasierer Monomed
P. J. Dahlhausen, Köln
Tierwaage
Tefal, Offenbach am Main
Ketanest® Ch. B.: 40923A
Pfizer GmbH, Karlsruhe
Domitor® Ch. B.: 1026548
Pfizer GmbH, Karlsruhe
Kohlenstoffdioxid (CO2)
Messer, Krefeld
9 Anhang
164
9.1.3 Verbrauchsmaterialien: Histologie und Immunhistologie
Material
Verwendung
Bezugsquelle
Na2HPO4 S-0876
Perfusionsfixierung
Sigma, St. Louis,
KH2PO4 P-5379
Chemikalien für PBS-
USA
NaCl 0278
Lösung
J.T.Baker, Deventer,
Niederlande
Paraformaldehyd
Perfusionsfixierung
Merck, Darmstadt
Perfusionsfixierung
B. Braun, Melsungen
2-Methylbutan 3927.1
Kryoeinbettung
Karl Roth, Karlsruhe
Flüssigstickstoff
Kryoeinbettung
Air Liquide, Krefeld
Tissue Tek® O.C.T™
Gefrierschnitte
Sakura,
1.04005.1000
Isotonische Kochsalzlösung
0,9% NaCl
Zouterwoude,
Compound, 4583
Niederlande
Aqua dest.
Sucrose
Histologie/
INI-Hannover,
Immunhistologie
Grundfos
Kryoprotektion
Sigma, St. Louis,
S-8501
OT Super Frost Plus,
USA
Gefrierschnitte
J1800AMNZ
Deckgläser
Menzel Gläser,
Braunschweig
Gefrierschnitte
24 x 60 mm # 1
Menzel Gläser,
Braunschweig
Salzsäure
Histologie/
1.09057.1000
Immunhistologie
Thermo Harris
H.E.-Färbung
Merck, Darmstadt
Thermo Shandon,
Hämatoxylin, 6765003
Pittsburgh,
Thermo Eosin Instant,
USA
6765540
9 Anhang
165
Ethanol Absolut
H.E.-Färbung
8006
J. T. Baker,
Deventer,
Niederlande
Xylol
H.E.-Färbung
8118
J. T. Baker,
Deventer,
Niederlande
Kresylechtviolett
Nissl-Färbung
Waldeck GmbH,
Münster
Natriumacetat
Nissl-Färbung
Merck, Darmstadt
Nissl-Färbung
J. T. Baker,
1.06268.0280
Essigsäure konz.
Deventer,
Niederlande
2-Propanol,
Nissl-Färbung
Merck, Darmstadt
Schnelleindeckmittel
Merck, Darmstadt
Detektion GLP-1 im Liquor
Biotrend,
1.09634.1000
Entellan,
1.07961.0500
GLP-1 (Active) ELISA
EGLP- 35K
Chemicalien GmbH,
Köln
Dipeptidyl Peptidase IV
Detektion GLP-1 im Liquor
Inhibitor DPP- 405
Biotrend,
Chemicalien GmbH,
Köln
Rabbit polyclonal antiserum
Primärantikörper
Biomol GmbH,
to GLP-1, GA 1176
GLP-1
Hamburg
Rabbit polyclonal antiserum
Primärantikörper
Biomol GmbH,
to GLP-1, GA 1176
GLP-1
Hamburg
Monoclonal Mouse Anti-
Primärantikörper
Sigma, St. Louis,
MAP-1, M 4278
MAP-1
USA
9 Anhang
166
Polyclonal Rabbit-anti-
Primärantikörper
GFAP,
GFAP
Dako, Hamburg
Z 0334
Monoclonal Mouse-anti-
Primärantikörper
Rat MHC II,
OX6
Linaris, Wertheim
MAK0046R
Swine-anti-Rabbit,
Dako, Hamburg
E 0353
GLP-1/GFAP
Goat-anti-mouse,
E 0433
MAP-1/OX6
Strept-AB-Komplex,
Immunhistologie
Dako, Hamburg
Immunhistologie
Dako, Hamburg
Immunhistologie
Dako, Hamburg
Immunhistologie
Linaris, Wertheim
Immunhistologie
Dako, Hamburg
Dako, Hamburg
K 0377
Normal Rat Serum,
X 0912
Normal Swine Serum,
X 0901
Normal Goat Serum,
EZN 1000
DiaminobenzidinTetrahydochlorid
DAB Chromagen, S 3000
9 Anhang
167
9.1.4 Geräte und Software
Gerät
Verwendung
Bezugsquelle
Mikrotom-Kryostat,
Gefrierschnitte
Microm International
Kryostar, HM 560 MV
Messer Sec 35, Low Profile
GmbH, Walldorf
Gefrierschnitte
Blades
Richard-Allan
Scientific,
Kalamazoo, USA
Omnilab MR 3001 K
Magnetrührer
Omnilab, Bremen
Kern 440-33
Chemikalienwaage
Gottl. Kern, Albstadt
Abzug
Histologie/
Köttermann,
Immunhistologie
Uetze-Hänigsen
Schüttler
Janke und Kunkel
Vibrax VXR basic Typ VX 7
GmbH, Staufen
Kühlschrank Liebherr
Lagerung Reagenzien
Liebherr, Biberach
an der Riss
Tiefkühlschrank Bosch
Lagerung OT
Bosch, GerlingenSchillerhöhe
Liebherr Gefriertruhe
Lagerung Liquor
GTP 3126
Sonepar GmbH,
Hannover
Mikroskop NC Varioskop
Vorbereitung Implantate
Wild, Heerbrugg
Mikroskop Zeiss NC 32
OP- Mikroskop
Carl Zeiss,
Oberkochen
Superlux 301
Lichtquelle
Carl Zeiss,
Oberkochen
Mikroskop BX 50 F4
Histologische Auswertung
Olympus, Hamburg
Kamera Leica DC 300
Histologische Auswertung
Leica, Solms
Stereotakt SAS 4120
Fixierung für Operation
ASI Instruments,
Warren,
USA
9 Anhang
168
Sterilbank Telstar
Vorbereitung Implantate
AH-100
Labotec
Labortechnik,
Göttingen
Sterilizer
Schnellsterilisation
FST Fine Science
Tools, Simon Keller
AG, Burgdorf,
Schweiz
Bohrer FST
Bohrlochtrepanation
FST Fine Science
Tools, Simon Keller
AG, Burgdorf,
Schweiz
Bohr- und Fräsgerät
Kraniotomie
Minimot 40/E
CCI Opto NCDT
Proxxon, Hellweg
Baumarkt, Hannover
Erzeugung Trauma,
Micro Epsilon
laseroptisches
Messtechnik,
Abstandsmessungs-
Ortenburg
system
Kompressor Profimaster
Erzeugung Trauma
Schneider Druckluft
Erzeugung White Noise
Toshiba, Düsseldorf
200-25
Clock Radio RC-7100
Beam Walking Test
Stopwatch Stopstar 2
Zeitmessung
Hanhart GmbH und
Untersuchung
Co. KG, Omnilab
Motorik und Verhalten
Digital Video Camera
Recorder DCR-PC 100E
Videoaufnahme
Sony, Köln
Testdurchführung
Wasserbecken 150 cm x
42,5 cm, Plastik
Plattform 11 cm x 26 cm,
Plexiglas, Stärke 4 mm
Hellweg Baumarkt,
Hannover
Hellweg Baumarkt,
Hannover
9 Anhang
169
Plexiglas, Stärke 4 mm
Wasserpumpe
Hannover
Grundfos, INIHannover
Photoshop
Bildbearbeitung
Adobe, San Jose,
Version 6.0
USA
Lab View
Erzeugung Trauma
National Instruments,
Version 5.0
Austin,
USA
Statview for Windows
Statistische Auswertung
SAS Institute Inc.,
Version 5.0
Cary, USA
9.2 Reagenzien
Alkoholreihe und Xylol
2x
30 sec.
70%
Ethanol
1x
30 sec.
90%
Ethanol
2x
30 sec.
100%
Ethanol
3x
1 min.
100%
Xylol
HCl-EtOH = Salzsäure-Alkohol-Mischung:
100 ml
Aqua dest.
100 ml
Ethanol absol.
50 ml
Salzsäure 1N
Kresylviolettlösung für Nissl-Färbung:
5g
Kresylechtviolett
60 ml
Natriumacetat
340 ml
Essigsäure 1M
600 ml
Aqua dest.
rühren für 1 Woche, Filtration, Lagerung bei 4°C, vor Licht schützen
9 Anhang
170
Perfusionsfixierung
PBS (Phosphatpuffer)
Laut Dako-Handbuch, 0,1 M auf 1 Liter Aqua dest. (pH 7,2)
1,48 g
Na2HPO4
0,43 g
KH2PO4
7,20 g
NaCl
1L
PBS (0,01 m)
40 g
PFA
PFA
unter Rühren auf 60°C unter Abzug erhitzen bis die Lösung klar, filtrieren,
Lagerung bei 4°C
Immunhistologie
StreptABKomplex = Streptavidin Biotinylierte Meerrettich Peroxidase:
1 Tropfen (45 µl)
Streptavidin
1 Tropfen (45 µl)
Biotin-Peroxidase
5 ml
PBS
30 Minuten vor Anwendung ansetzen
DAB = Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid:
1 Tabl.
DAB
10 ml
PBS
Herstellung der Stammlösung unter Lichtschutz, Konzentration: 1 mg/ml,
Lagerung bei -20°Celsius in 2 ml-Portionen, vor Anwendung bei RT auftauen
und Zugabe von 15 µl 3%iges H2O2 zu 2 ml DAB.
9 Anhang
171
9.3 Färbeprotokolle
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Zeit
30 min.
OT bei Raumtemperatur auftauen
10 min.
Spülen mit Leitungswasser
3 min.
Inkubation mit Hämatoxylin
10 min.
Wässern mit Leitungswasser zum Bläuen
1 Sek.
Differenzieren in 0,15% HCl-EtOH
5 min.
Spülen mit Leitungswasser
3 min.
Spülen mit Aqua dest.
1 min.
Inkubation mit Eosin
2x
70% Ethanol
2x
96% Ethanol
2x
100% Ethanol
3x
100% Xylol
Eindecken mit Entellan
Nissl-Färbung
Zeit
30 min.
1 min.
Spülen mit Aqua dest.
8 min.
Inkubation mit 0,5% Kresylechtviolett-Lösung (39° C)
10 Sek.
Gemisch 0,1 ml konz. Essigsäure auf 0,1 l Aqua dest.
3 min.
70% Ethanol
3 min.
96% Ethanol
1 Sek.
Gemisch 0,1 ml konz. Essigsäure auf 0,1 l 96% Ethanol
2 x 5 min.
100% Isopropanol
2x 5 min.
100% Xylol
Eindecken mit Entellan
9 Anhang
172
GLP-1 Färbung
Zeit
30 min.
3 x 5 min.
waschen mit PBS
im Dunkeln:
15 min.
0,6% H2O2 in Methanol (4 ml 30%ig H2O2 + 196 ml MtOH)
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween (200 µl Tween auf 200 ml PBS)
In feuchte Kammer legen
3x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
über Nacht bei
4°C
PrimärAK in 1% BSA-PBS
30 min.
OT bei Raumtemperatur aufwärmen
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
SekundärAK Swine-anti-Rabbit
60 min.
in 5% NRS-1,5% NSS-PBS
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
30 min.
StreptABKomplex
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
5 min.
DAB im Dunkeln unter Abzug:
3 x 5 min.
PBS waschen
aus feuchter Kammer nehmen
kurz
In Leitungswasser spülen
2 min.
Hämatoxylingegenfärbung
5 min.
Spülung mit Leitungswasser zum Bläuen
1 Sek.
Differenzierung mit HCl in EtOH
Alkoholreihe (entwässern), eindecken mit Entellan
Verdünnung:
PrimärAK: GLP-1 1:500, SekundärAK: 1:400
9 Anhang
173
MAP-1 Färbung/ OX6-Färbung
Zeit
30 min.
3 x 5 min.
waschen mit PBS
im Dunkeln:
15 min.
0,6% H2O2 in Methanol (4 ml 30%ig H2O2 + 196 ml MtOH)
3 x 5 min.
3x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
über Nacht bei
4°C
30 min.
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
SekundärAK Goat-anti-Mouse
60 min.
in 5% NRS-1,5% NGS-PBS
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
30 min.
StreptABKomplex
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
5 min.
3 x 5 min.
PBS waschen
kurz
2 min.
5 min.
1 Sek.
Verdünnung:
PrimärAK: MAP-1 1:500, SekundärAK: 1:400
PrimärAK: OX6 1:100, SekundärAK: 1:50
9 Anhang
174
GFAP- Färbung
Zeit
30 min.
3 x 5 min.
waschen mit PBS
im Dunkeln:
15 min.
0,6 % H2O2 in Methanol (4 ml 30%ig H2O2 + 196 ml MtOH)
3 x 5 min.
20 min.
5 % NSS-PBS
über Nacht bei
4°C
30 min.
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
SekundärAK Swine-anti-Rabbit
60 min.
in 5% NRS-1,5% NSS-PBS
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
30 min.
StreptABKomplex
3 x 5 min.
PBS + 0,1%ig Tween
5 min.
3 x 5 min.
PBS waschen
kurz
2 min.
5 min.
1 Sek.
Verdünnungen:
PrimärAK: GFAP 1:200, SekundärAK: 1:100
9 Anhang
175
9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung
9.4.1 Protokoll: Operation
Projekt
Tier
GLP
GLP
Tag der
Einstellung
Injektionsnarkose i.p.
KGW
(g)
männlich (m) OPweiblich (w) Datum
Uhrzeit
Dosierung
Stereotaktische Implantation CellBeads®
Nadel
IA0
AP
Bregma
LM
DV
CellBeads® Charge
ml Ketanest®
ml Domitor®
Nadel
Differenz
Gesamtgröße
Koordinaten
AP
LM
-1 mm
-2 mm
DV
-6 mm/-5 mm
Anzahl Cellbeads®
Vorher
Nachher
OPDauer
AP
LM
DV
Tag der Ankunft
Bregma
OPBeginn
Ergebnis
Anzahl implantiert Injektions-Gesamtvolumen
µl
Zeitdauer der Applikation (Sek.)
Controlled Cortical Impact
Bregma
AP
LM
Kraniotomie
Schusszylinder
Koordinaten
Ergebnis
-3 mm
-4 mm
6 mm Durchmesser
5 mm Durchmesser, Geschwindigkeit:
3 m/sek., 2 mm Tiefe, 150 ms Dauer
AP= anterior-posterior, LM= lateral-medial, DV= dorsal-ventral
Perfusionsdatum:
Operateur:
Anmerkungen:
9 Anhang
176
9.4.2 Protokoll: Gefrierschneidetechnik
Projekt:
GLP-1 sezernierende mesenchymale alginatverkapselte Stammzellen zur
Neuroprotektion nach Schädel-Hirn-Trauma
Tier:
Tiernummer:
Versuchsgruppe:
Objekt: Gehirn
Perfusion:
Datum:
Substanzen: 0,9% NaCl, 4% PFA
Kryoeinbettung:
Datum:
Substanzen:
Schneiden des Objektes:
Datum:
Objektträger: Superfrost®
Schnittdicke: 20 µm
Mikrotom: HM 560
ObjektträgerNummer
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Schnitte
pro OT
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Anmerkungen:
Ventrikelsystem
Stichkanal
CellBeads®
Kontusionstrauma
Aufnahme
jedes x.
Schnittes
sichtbar ab:
sichtbar ab:
sichtbar ab:
sichtbar ab:
ObjektträgerNummer
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Schnitte
pro OT
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Objektträger
Objektträger
Objektträger
Objektträger
/
/
/
/
Aufnahme
jedes x.
Schnittes
Schnitt
Schnitt
Schnitt
Schnitt
9 Anhang
9.4.3 Protokoll: Beam Balance Test
Versuchsgruppe:
Tiernummer:
Trainingstag 1 vor OP
Verweildauer auf Balken in Sekunden (max. 60 Sekunden)
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Trainingstag 1 nach OP
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
177
9 Anhang
9.4.4 Protokoll: Beam Walking Test
Versuchsgruppe:
Tiernummer:
Trainingtag 1 vor OP
Latenzzeit zum Erreichen der Zielbox in Sekunden
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Trainingtag 1 nach OP
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Summe
Mittelwert
178
9 Anhang
179
9.4.5 Protokoll: Morris Water Maze Test
Versuchsgruppe:
Tiernummer:
Position Zielplattform:
Suchlatenzzeit in Sekunden (max. 120 Sekunden)
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
HP
Fehlversuche
HP
Fehlversuche
HP
Fehlversuche
HP
Fehlversuche
HP
Fehlversuche
9 Anhang
180
SP
Verweildauer in Plattformquadranten (max. 120 Sekunden)
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
VP
Fehlversuche
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
VP
Fehlversuche
Durchgang 1
Durchgang 2
Durchgang 3
Durchgang 4
Summe
Mittelwert
HP= Hidden Platform Version
SP= Spatial Probe
VP= Visible Platform Version
9 Anhang
181
9.5 Statistik
9.5.1 Deskriptive Statistik
Zur deskriptiven, statistischen Auswertung wurden für die einzelnen
Versuchsgruppen an den entsprechenden Versuchstagen die Mittelwerte,
Standardabweichungen, Standardfehler, und die Minimal- und Maximalwerte
bestimmt. Gruppenbezeichnungen: Kontrolltiere, Kontusionstrauma (CCI),
Kontusionstrauma und Implantation leerer CellBeads® (CCI + leere CB),
Kontusionstrauma und Implantation GLP-1 sezernierender CellBeads® (CCI +
CB mit GLP-1).
Beam Balance Test
Tag 1 vor OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
22,29777
8,116
2,705
12,450
40,740
34,776
18,885
5,972
8,420
60,000
32,83777
13,478
4,493
14,030
58,380
23,729
6,153
1,946
13,560
30,900
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
28,94555
9,080
3,027
18,510
43,520
13,734
4,607
1,457
6,600
21,530
10,898
3,293
1,041
7,000
16,350
10,987
2,550
0,8063
8,720
15,940
Tag 1 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
182
Tag 2 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
30,85
9,436
3,145
22,080
46,210
32,257
13,937
4,407
13,250
49,440
18,399
9,379
2,966
7,320
31,260
16,437
2,119
0,6702
12,930
19,510
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
37,50888
7,888
2,629
26,861
49,420
30,799
12,776
4,040
15,280
53,720
25,404
16,001
5,060
8,000
55,990
20,769
4,242
1,341
16,340
28,420
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
42,24
6,531
2,177
31,080
52,710
44,853
15,654
4,950
20,660
60,000
30,366
12,670
4,007
14,100
52,690
26,205
4,664
1,475
19,150
32,100
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
46,45222
4,765
1,588
40,820
53,800
54,273
6,517
2,061
44,020
60,000
37,46
13,740
4,345
18,210
60,000
44,022
9,178
2,902
25,600
53,430
Tag 3 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 4 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 5 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
183
Beam Walking Test
Tag 1 vor OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
7,193333
0,9086
0,3029
6,800
8,860
9,949
3,525
1,115
5,530
19,050
9,623
3,070
0,9708
8,590
15,010
12,929
3,948
1,249
5,430
18,850
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
4,281111
1,104
0,3681
3,150
6,690
15,738
3,196
1,011
11,280
22,570
15,457
4,635
1,466
10,530
25,260
11,783
2,524
0,7981
8,710
17,740
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
3,616666
1,284
0,4281
2,1270
6,190
8,759
1,811
0,5727
6,140
11,810
8,056
1,903
0,6016
5,230
11,410
6,225
1,674
0,5295
4,400
9,150
Tag 1 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 2 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
184
Tag 3 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
3,1011
0,8285
0,2762
2,150
4,500
6,623
2,604
0,8235
3,980
11,910
6,71
1,598
0,5054
4,490
9,940
4,424
0,6562
0,2075
3,540
5,940
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
2,917777
0,8034
0,2678
2,040
4,270
5,087
1,154
0,3651
3,330
7,140
5,667
1,496
0,4731
3,610
8,160
3,999
0,8882
0,2809
2,980
5,530
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
2,657777
0,4560
0,1520
2,000
3,490
4,428
1,485
0,407
2,790
7,380
4,42
1,029
0,3255
2,750
5,600
3,294
0,5167
0,1634
2,560
4,050
Tag 4 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 5 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
185
Tag 14 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
42,97
4,175
1,392
37,830
48,700
78,018
33,676
10,649
30,630
120,00
79,698
21,207
6,706
49,660
112,51
63,638
19,745
6,244
35,610
96,880
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
14,53
3,161
1,054
11,010
19,580
30,531
21,110
6,675
11,190
76,710
30,411
12,217
3,863
15,520
56,650
23,373
11,315
3,578
13,830
44,880
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
8,901111
1,445
0,4818
6,461
10,840
17,608
7,920
2,505
9,010
36,580
21,848
5,881
1,860
13,180
30,790
17,117
4,135
1,308
10,050
24,200
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
7,427777
1,243
0,4142
5,680
9,410
14,454
6,050
1,913
8,440
27,750
15,666
6,819
2,157
7,870
29,180
11,524
3,019
0,9546
6,150
15,590
Tag 15 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 16 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 17 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
186
Tag 18 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
6,157777
1,032
0,3441
4,690
7,610
10,274
3,399
1,075
4,110
16,920
10,695
3,868
1,223
6,320
16,110
8,412
1,926
0,6092
5,910
11,790
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
57,8666
5,318
1,773
49,000
63,980
46,33
6,493
2,553
37,330
53,980
43,229
9,105
2,879
30,520
60,000
48,705
2,965
0,9377
42,180
53,020
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
4,6444
0,8712
0,2904
3,100
5,870
7,88
4,208
1,331
2,870
16,100
8,459
2,890
0,914
4,690
13,990
5,519
1,815
0,5741
2,590
7,920
Mittelwert
(Mean)
Standardabweichung
(SD)
Standardfehler
(SEM)
Minimum
Maximum
4,22444
0,8778
0,2926
3,400
6,140
6,241
2,506
0,7924
2,930
10,960
7,401
2,205
0,6974
4,190
10,300
4,964
1,315
0,4273
3,170
6,920
Tag 19 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 20 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
Tag 21 nach OP
Versuchsgruppe
Kontrolltiere
(9 Tiere)
CCI
(10 Tiere)
CCI + leere CB
(10 Tiere)
CCI + CB mit
GLP-1
(10 Tiere)
9 Anhang
187
9.5.2 Statistisches Testverfahren: Fischer-Test
Beam Balance Test
Vergleich der Verweilzeiten auf der Versuchsapperatur in Sekunden Tag 1 vor
bis Tag 5 nach den Operationen mit Gruppenvergleichen mit Hilfe des FischerTests.
Fischer-Test: Tag 1 vor OP
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
11,047
Crit. Diff.
11,415
P-Value
,0574
CCI
CCI + leere CB
2,105
11,415
,7104
CCI
Kontrolltiere
12,478
11,728
,0377
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-8,942
11,415
,1208
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
1,431
11,728
,8058
CCI + leere CB
Kontrolltiere
10,373
11,728
,0812
Mean Diff.
2,747
Crit. Diff.
4,869
P-Value
,2598
Signifikanz s
s
Fischer-Test: Tag 1 nach OP
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Signifikanz s
CCI
CCI + leere CB
2,896
4,869
,2353
CCI
Kontrolltiere
-15,212
5,002
<,0001
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
,149
4,869
,9508
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-17,959
5,002
<,0001
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-18,108
5,002
<,0001
s
Mean Diff.
15,820
Crit. Diff.
8,806
P-Value
,0009
Signifikanz s
s
s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
13,858
8,806
,0030
CCI
Kontrolltiere
1,407
9,047
,7541
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-1,962
8,806
,6538
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-14,413
9,047
,0027
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-12,451
9,047
,0084
s
Mean Diff.
10,030
Crit. Diff.
10,218
P-Value
,0541
Signifikanz s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
5,395
10,218
,2911
CCI
Kontrolltiere
-6,710
10,498
,2029
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-4,635
10,218
,3634
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-16,740
10,498
,0026
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-12,105
10,498
,0251
s
9 Anhang
188
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
18,648
Crit. Diff.
9,930
P-Value
,0005
Signifikanz s
s
s
CCI
CCI + leere CB
14,487
9,930
,0055
CCI
Kontrolltiere
2,613
10,203
,6064
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-4,161
9,930
,4007
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-16,035
10,203
,0030
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-11,874
10,203
,0238
s
Mean Diff.
10,251
Crit. Diff.
8,435
P-Value
,0187
Signifikanz s
s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
16,813
8,435
,0003
CCI
Kontrolltiere
7,821
8,666
,0755
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
6,562
8,435
,1233
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-2,430
8,666
,5728
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-8,992
8,666
,0424
s
Beam Walking Test
Vergleich der Latenzzeiten in Sekunden Tag 1 bis Tag 5 nach den Operationen
mit Gruppenvergleichen mit Hilfe des Fischer-Tests.
Fischer-Test: Tag 1 vor OP
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
-2,980
Crit. Diff.
2,844
P-Value
,0406
Signifikanz s
s
CCI
CCI + leere CB
,326
2,844
,8174
CCI
Kontrolltiere
2,756
2,922
,0638
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
3,306
2,844
,0240
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
5,736
2,922
,0003
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
2,430
2,922
,1003
Mean Diff.
3,955
Crit. Diff.
2,881
P-Value
,0085
CCI + leere CB
,281
2,881
,8442
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
Signifikanz s
s
CCI
Kontrolltiere
11,457
2,960
<,0001
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-3,674
2,881
,0139
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
7,502
2,960
<,0001
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
11,176
2,960
<,0001
s
9 Anhang
189
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
2,534
Crit. Diff.
1,539
P-Value
,0020
Signifikanz s
s
CCI
CCI + leere CB
,703
1,539
,3600
CCI
Kontrolltiere
5,142
1,581
<,0001
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-1,831
1,539
,0211
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
2,608
1,581
,0019
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
4,439
1,581
<,0001
s
Mean Diff.
2,199
Crit. Diff.
1,483
P-Value
,0048
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
-,087
1,483
,9059
CCI
Kontrolltiere
3,522
1,524
<,0001
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-2,286
1,483
,0035
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
1,323
1,524
,0867
CCI + leere CB
Kontrolltiere
3,609
1,524
<,0001
s
Mean Diff.
1,088
Crit. Diff.
1,023
P-Value
,0377
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
-,580
1,023
,2574
CCI
Kontrolltiere
2,169
1,051
,0002
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-1,668
1,023
,0022
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
1,081
1,051
,0440
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
2,749
1,051
<,0001
s
Mean Diff.
1,134
Crit. Diff.
,888
P-Value
,0138
Signifikanz s
s
,008
,888
,9855
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
CCI
Kontrolltiere
1,770
,912
,0004
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-1,126
,888
,0144
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
,636
,912
,1655
CCI + leere CB
Kontrolltiere
1,762
,912
,0004
s
9 Anhang
190
Vergleich der Latenzzeiten in Sekunden Tag 14 bis Tag 21 nach den
Operationen mit Gruppenvergleichen mit Hilfe des Fischer-Tests.
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
14,380
Crit. Diff.
20,533
P-Value
,1640
Signifikanz s
CCI
CCI + leere CB
-1,680
20,533
,8690
CCI
Kontrolltiere
35,040
21,096
,0018
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-16,060
20,533
,1213
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
20,660
21,096
,0547
CCI + leere CB
Kontrolltiere
36,720
21,096
,0012
s
Mean Diff.
7,158
Crit. Diff.
12,454
P-Value
,2512
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
,0120
12,454
,9845
CCI
Kontrolltiere
15,998
12,795
,0157
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-7,038
12,454
,2591
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
8,840
12,795
,1696
CCI + leere CB
Kontrolltiere
15,878
12,795
,0165
s
Mean Diff.
,491
Crit. Diff.
4,964
P-Value
,8420
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
-4,240
4,964
,0917
CCI
Kontrolltiere
8,707
5,100
,0014
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-4,731
4,964
,0611
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
8,216
5,100
,0024
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
12,947
5,100
<,0001
s
Mean Diff.
2,930
Crit. Diff.
4,454
P-Value
,1903
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
-1,212
4,454
,5842
CCI
Kontrolltiere
7,026
4,576
,0036
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-4,142
4,454
,0673
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
4,096
4,576
,0777
CCI + leere CB
Kontrolltiere
8,238
4,576
,0008
s
s
9 Anhang
191
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
Mean Diff.
1,862
Crit. Diff.
2,570
P-Value
,1503
Signifikanz s
CCI
CCI + leere CB
-,421
2,570
,7415
CCI
Kontrolltiere
4,116
2,641
,0032
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-2,283
2,570
,0800
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
2,254
2,641
,0919
CCI + leere CB
Kontrolltiere
4,537
2,641
,0013
s
Mean Diff.
-2,375
Crit. Diff.
5,805
P-Value
,4118
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
3,101
5,805
,2856
CCI
Kontrolltiere
-11,557
5,964
,0004
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
5,476
5,805
,0637
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
-9,182
5,964
,0036
s
CCI + leere CB
Kontrolltiere
-14,658
5,964
<,0001
s
Mean Diff.
2,361
Crit. Diff.
2,523
P-Value
,0657
Signifikanz s
s
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
-,579
2,523
,6442
CCI
Kontrolltiere
3,236
2,592
,0159
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-2,940
2,523
,0237
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
,875
2,592
,4979
CCI + leere CB
Kontrolltiere
3,815
2,592
,0051
s
Mean Diff.
1,277
Crit. Diff.
1,701
P-Value
,1365
Signifikanz s
-1,160
1,701
,1750
CCI
Gruppenvergleich
CCI + CB mit GLP-1
CCI
CCI + leere CB
CCI
Kontrolltiere
2,017
1,748
,0250
s
CCI + CB mit GLP-1
CCI + leere CB
-2,437
1,701
,0063
s
CCI + CB mit GLP-1
Kontrolltiere
,740
1,748
,3962
CCI + leere CB
Kontrolltiere
3,177
1,748
,0008
s
9 Anhang
192
9.6 Danksagung
Hiermit möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. T. Brinker für die Überlassung
meines Dissertationsthemas und für die Unterstützung bei der Durchführung
und Abfassung der Arbeit herzlich bedanken. Dabei danke ich besonders für die
Anstellung durch die Internationale Stiftung Neurobionik Hannover und das
verlässliche Krisenmanagement in Phasen der doktorandigen Verzweiflung.
Bei Herrn Prof. Dr. H. J. Hedrich möchte ich mich sehr herzlich für die
verlässliche Betreuung meiner Dissertation und die kontinuierliche
Unterstützung und Hilfe bedanken. Herrn Prof. Dr. M. Samii danke ich für die
Bereitstellung des Forschungsbereiches des INI Hannover. Bei Herrn PD Dr. A.
Samii möchte ich mich herzlich für die Unterstützung bei der Durchführung
meiner Doktorarbeit und für die praktische, operative Anleitung bedanken.
Herrn Dr. S. Lindemann möchte ich sehr danken für die stetige Hilfe während
der gesamten Arbeit. Frau Dr. P. Klinge danke ich ganz besonders für die sehr
freundliche Unterstützung und die Hilfestellung bei der histologischen
Auswertung. Frau A. Maniera möchte ich von ganzem Herzen für die
Hilfsbereitschaft sowie für die Hilfe bei der Bewältigung der im Labor
anfallenden Arbeiten danken. Bei der Firma Cellmed AG möchte ich mich für
die Bereitstellung der Implantate und die freundliche, verlässliche Unterstützung
zur Durchführung der Untersuchungen bedanken. Der Internationalen Stiftung
Neurobionik Hannover danke ich für die finanzielle Unterstützung.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie, die mich immer unterstützt und
aufgebaut hat. Ohne Euch hätte ich das nicht geschafft!
Aus Platzgründen leider nur die kurze Version, aber von Herzen ganz lieben
Dank an die ganze Laborcrew: Ivonne, Kerstin (dem Dativ meine Retterin)
Rhea, Caro, Uta, Isabel, Luer und Tobias, es war eine Superzeit mit Euch!
Danke lieber Alex für die Hilfe bei der englischen Übersetzung. Last, but not
least, liebe Katja und lieber Kai, danke für die seelische Unterstützung und
sorry für die hohen Telefonkosten!

GLP-1 sezernierende mesenchymale

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Abiturrede von 1970 aus Waldbröl, die für großen Aufruhr sorgte!!

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