Assays in der Wirkstoffentwicklung Auffindung neuer Leitstrukturen

Assays in der
Wirkstoffentwicklung
Bewertung der biologischen Aktivität von Wirkstoffen
Verschiedene Problembereiche
• Auffindung neuer Leitstrukturen
– Hochdurchsatztestung
• Profilierung von Leitstrukturen
– Wirkspektrum
– Selektivität
• Weitergehende Charakterisierung
– In-vivo-Wirksamkeit
– Pharmakokinetik (ADMETox)
Prof. Dr. Manfred Jung
Auffindung neuer Leitstrukturen
Hochdurchsatztestung
High-throughput-Screening (HTS, uHTS)
• Homogene vs. Heterogene Systeme
Zellfreie Systeme
Isolierte bzw. aufgereinigte Enzyme, Rezeptoren
• Enzymhemmung, Rezeptoraffinität
• Methoden der Molekularbiologie und Chromatographie
Zelluläre Systeme
Mikroorganismen, Krebszellen
• Nativ oder rekombinant verändert
funktionelle Assays (Phänotyp, Second messenger, Reportergen)
Prof. Dr. Manfred Jung
1
Zellululäre Systeme
Vorteile: Netto-Effekt erfaßt
Zellpermeabilität, Toxizität, Selektivität, Agonismus/Antagonismus
Nachteile: falsch-negative z. B. aufgrund Permeabilität
Native Systeme
Bakterien, Pilze, Krebszellen
meist phänotypischer Readout
• Proliferation, Cytotoxizität, Apoptose, Differenzierung
Rekombinante Zellen
z.B. Überexpression von Rezeptoren
• Second-messenger-Messung
Reportergen-Assays
Prof. Dr. Manfred Jung
Zelluläre Systeme
Proliferation von Zellen
Sulforhodamin B-Test (SRB)
• Bestimmung der Gesamtproteinmenge
• Korrelation mit Zellzahl
– relativ zur Kontrolle
Cytotoxizität
Metabolische Aktivität (auch für Proliferation)
– Quantifizierung über Tetrazolium-Salze
(MTT, XTT)
MeO
Zelllyse
• Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase-Aktivität
oder Aufnahme von Farbstoffen
O2N
O
N
N
N
XTT
H
OMe
N N
+
_
SO3
_
SO3
NO 2
Prof. Dr. Manfred Jung
2
Zelluläre Systeme
Funktionelle Assays über Second messenger
z.B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
Reportergen-Konstrukt
• cAMP-responsiver Promotor
• Luciferase als Genprodukt
– Chemolumineszenz
H
HO
N
N
S
S
COOH
HO
N
N
S
S
O
Prof. Dr. Manfred Jung
Zelluläre Systeme
Funktionelle Assays über Second messenger
z.B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
• Ca2+-Freisetzung
– Zellpermeable Calcium-Liganden
– Emissionswellenlänge des Komplexes verschoben
Fluo-4 AM
AM: Acetoxymethylester
Intrazelluläre Esterspaltung, Anion-Ligand
Prof. Dr. Manfred Jung
3
Zellfreie Systeme
Fokussierung auf Target
nicht unbedingt auf Wirkung
Höhere Reproduzierbarkeit
Weniger aufwändig
Stärkere Miniaturisierung und höherer Durchsatz
möglich
Verfahren teilweise auch in Zellen anwendbar
Prof. Dr. Manfred Jung
Allgemeine Prinzipien
Oft Immobilisierung von Substraten nötig
meist Streptavidin-Biotin
HOOC
• Protein aus Streptomyces avidinii
• Bindung zu Biotin extrem fest, KD = 10-15 M
• Biotinylierung von Oligopeptiden gut möglich
Erkennung von Substratmodifkationen
H
S
4
6a
3a
H H
H
N
O
N
H
Biotin (3a-S, 4-S, 6a-R)
z.B. Phosphorylierung, Acetylierung
Spezifische Antikörper
• z.B. Unterscheidung Lysin-Acetyllsin
Auch für zelluläre Untersuchungen
Prof. Dr. Manfred Jung
4
Radioaktive Assays
Isotope: Tritium, 125I (35S, 33P)
Heterogene Verfahren (Filtration, Adsorption etc.)
Homogene Verfahren
•
•
•
•
•
Scintillation proximity assay (SPA), FlashplateR
Scintillationsreagenz in feste Phase eingebettet
Substrat an feste Phase angebunden
nur bei Nähe Signal
Beispiel Histon-Desacetylase (HDAC)
O
Oligopeptid-
SPA-Bead
Oligopeptid
Biotin
Streptavidin
N
Signal
O
Oligopeptid
O
HDAC
N
H
Oligopeptid-
N
H
H
NH 3+
C[3H]3
+ [3H]3CCOO-
Kein Signal
Prof. Dr. Manfred Jung
Absorption
Reaktion liefert Chromophor mit anderen spektralen
Eigenschaften
z.B. para-Nitrophenol-Glucuronid in Reportergenassays
O
O
OH
O
HO
O2N
OH
O
_
Glucuronidase
O
HO
O2N
HO
OH
farblos
O
OH
OH
OH
Gelb ( =415 nm)
z.B. NADH/NAD+
Bestimmungsgrenze oft nicht zufriedenstellend
Prof. Dr. Manfred Jung
5
Histone
Basische Proteine
reich an Arginin- und Lysinresten
Modifikationen der Seitenketten einzelner Aminosäuren
durch Enzyme
Acetylierung, Desacetylierung (Lysin)
Methylierung, Demethylierung (Lysin, Arginin)
epigenetische Transkriptionsregulation
´Lesezeichen´
Enzyme: Targets für die Wirkstoffforschung
• auch Modifikationen von Nicht-Histon-Proteinen !
Prof. Dr. Manfred Jung
Forschungsschwerpunkt
Wirkstofffindung (Enzymhemmstoffe)
Synthese von Inhibitoren
Leitstruktur basiert
• Struktur-Wirkungsbeziehungen
Assay-Entwicklung
Nicht-radioaktive In-vitro-Assays (HTS)
Random Screening
Vorauswahl: Virtuelles Screening; fokussierte Bibliotheken
Neue Leitstrukturen
Prof. Dr. Manfred Jung
6
Acetylierung - Desacetylierung
Reversible Acetylierung von Lysinresten durch
Histon-Desacetylasen (HDAC) und
-Acetyltransferasen (HAT)
O
O
NH3+
R´
H
N
H
HAT
N
R´
HDAC
H
R
N
R
CH3
O
Prof. Dr. Manfred Jung
Histon-Desacetylasen
„Klassische“ Histon-Desacetylasen
Klasse I und II (insgesamt 11 Subtypen)
zinkabhängige Amidohydrolasen
Hemmstoffe in klinischen Studien (Krebstherapie)
Sirtuine
auch Klasse III-Histon Desacetylasen genannt
NAD+-abhängige Enzyme (7 Subtypen)
Bildung von O-Acetyl-ADP-Ribose
Prof. Dr. Manfred Jung
7
Sirtuine
Desacetylierung NAD+-abhängig
Produkt O-Acetyl-ADP-Ribose Signaltransduktion ?
Erhöhung der Lebensspanne
nachgewiesen in Hefe und Fadenwurm
Verknüpfung mit Kalorienaufnahme ?!
Therapeutisches Potential von Hemmstoffen ?
Sirtuine desaktivieren p53
Sirtuine aktivieren Onkogen BCL-6 in Lymphom
Sirtuine nötig für HIV-Transkription (tat)
Prof. Dr. Manfred Jung
Sirtuine
Transacetylierung,
Esteraseaktivität
mit anderen Substraten ?
H
O
N
R´
N
H
CH3
O
NH3+
R´
O
R
H
H2O
O
N
NH2
O
O
N
O P O
O
P
O P O
HO
O
O
HO
NH2
OH
N
O
N
N
OH
NH2
OH
N
H3C
NAD+
O
NH2
O
O
P
O
O
N
Prof. Dr. Manfred Jung
Nicotinamid
O
HO
O
O
O
+
O
R
HO
N
O
N
OH
N
N
O-Acetyl-ADPRibose
8
Sirtuin-Hemmstoffe
Nur wenige Beispiele
Nicotinamid (30 – 200 µM)
Splitomicine, Sirtinol
Potente und selektive Vertreter von uns
R
N
R
O
O
N
O
O
OH
R
Sirtinol
(Schreiber)
O
Splitomicine
(Simon, Jung)
Prof. Dr. Manfred Jung
Br
HR73, IC50 (Sirt1) = 5 µM
hemmt HIV-tat-Desacetylierung
Fluoreszenz
Hohe Sensitivität
Direkte Fluoreszenz
Reaktion liefert Fluorophor mit anderen spektralen Eigenschaften
z.B.Aminomethylcoumarin (AMC)-Freisetzung aus Amiden
durch Proteasen (z.B. Trypsin)
O
O
H
N
O
H
N
Em
CH3
O
O
Ex =
Trypsin
H
N
O
CH3
330 nmHDAC
= 395 nm
O
O
O
H
N
H
N
O
H
N
CH3
Trypsin
H
O
O
CH3
O
H
Ex =
Prof. Dr. Manfred Jung
Em
O
355 nm
NH2 HO
N
O
H
N
H
O
= 460 nm
9
FRET
Fluorescence-resonance-energy-transfer
Zwei Fluorophore, Donor-Emission überlappt mit Acceptor-Abs.
Strahlungsloser Energietransfer nur unterhalb kritischer
Entfernung (Förster-Distanz: 50 % Donor deaktiviert)
Auslesen von Acceptor-Emission oder Löschung (Quenching)
der Donor-Emission
Edans
Dabcyl
Prof. Dr. Manfred Jung
Fluoreszenzquenching
Intramolekulare Löschung von Fluoreszenz
Derivatisierung nach Umsetzung, Bsp. HDAC
O
O
H
N
O
H
N
O
H
N
CH3
O
CH 3
HDAC
H
H
O
CH3
O
O
Restsubstrat fluoresziert
O
O
H
N
H
N
O
O
Prof. Dr. Manfred Jung
H
N
NDA
O
N
H
HS-(CH2)2-OH
S-CH2-CH2-OH
Intramolekulares Quenching
im Metaboliten
10
Fluoreszenzpolarisation
Anregungslicht linear polarisiert
wenn Molekül fixiert ist bzw. geringe Beweglichkeit zeigt
Emissionslicht auch polarisiert
wenn Viskosität der Lösung und Temperatur konstant
Ausmaß der Polarisation im Emissionslicht proportional
zum molekularen Volumen
• bei kleinen Molekülen: Ausmaß der Bindung an ein großes Molekül
• Vorteil: homogenes System, relative Bindung ohne Abtrennung
bestimmbar
• Polarisation (Anisotropie): dimensionslose Meßwerte für Ausmaß
der Polarisation
Prof. Dr. Manfred Jung
Fluoreszenzpolarisation
Messung der Emission in zwei Ebenen
Polarisationswert [P] = Intensität vertikal – Intensität horizontal
Prof. Dr. Manfred Jung
Intensität vertikal+ Intensität horizontal
11
Fluoreszenzpolarisation
Titration von humanem Serum-Albumin mit
fluoreszenzmarkierten Aminosäuren
Verdrängung mit Arzneistoffen
Dansyl-L-Aspartat
c [Dans yl-G A BA ] = c [HSA ] = 1 0 µ M
Dansyl-GABA
Dansyl-Sarcosin
200
Anisotropie [mA]
Anisotropie [mA]
200
100
0
0.01
0.1
1
10
100
(S) -Napr oxen
Flurbiprofen
Ibuprofen
Pheny lbutazon
100
0
0.01
0.1
1
10
10000
100
1000
10000
Ar z neistoff- K onz entrationen [µM]
HSA [µM]
Prof. Dr. Manfred Jung
Fluoreszenzpolarisation
Homogener Kinase-Assay
Sonde
(engl.: Probe)
Fluorophor-Oligopeptid-
Oligopeptid
O
O
N
H
Oligopeptid-
Oligopeptid-
Substrat
N
H
OH
_
OPO3
Kinase
ATP
O
Serinphosphatspezifischer Antikörper
Oligopeptid-
N
H
Verdrängung
der Sonde
Polarisation nimmt ab
Oligopeptid_
OPO3
Prof. Dr. Manfred Jung
12
Time-resolved-fluorescence (TRF)
Lanthaniden-Komplexe zeigen sehr lange
Fluoreszenzemission (bis 1000 ns, normal 1-10 ns)
Messung z.B. zwischen 300 und 800 ns
• Größere Fläche unter der Kurve
• Sehr geringe Hintergrundinterferenz
• Sehr niedrige Nachweisgrenzen
Oft mit Europium-gelabelten Antikörpern
Einsatz in kommerziellen klinisch-chemischen Assays
• DelfiaR
Prof. Dr. Manfred Jung
Time-resolved-fluorescence (TRF)
Termschema und Anregungssequenz
Ligand
Prof. Dr. Manfred Jung
Aus Diss. Z. Lin Regensburg 2004
13
Time-resolved-fluorescence (TRF)
Oft Sandwich-Immunoassays
Definierte Waschschritte nötig
Beispiel: Kinase-Assay
Biotin
Streptavidin
Anregung
N
H
O
Oligopeptid
O
Oligopeptid-
Platte
Oligopeptid-
Kinase
OH
ATP
N
H
Oligopeptid
_
OPO3
Serin
Fluoreszenz
1. Serinphosphatspezifischer Antikörper
2. Anti IgG-Antikörper
mit Label, hier Eu-Komplex
EuChelat
Prof. Dr. Manfred Jung
3. H+, Zerstörung
des Komplexes,
Enhancer-Zugabe
Eu3+
Time-resolved-fluorescence (TRF)
Labelling
Detektion
Naphthoyltrifluoraceton (NTA)
O
O
CF3
Prof. Dr. Manfred Jung
14
AlphaScreenR
Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay
auch LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)
nur bei Nähe von Donor- und Akzeptorbead Signal
Beispiel: homogener Kinase-Assay
O
Donor
Bead
Oligopeptid-
N
H
Oligopeptid
_
OPO3
Sensitizer
Anregung
3O
2
1O
2
Acceptor
Bead
Chemolumineszenz
Prof. Dr. Manfred Jung
AlphaScreenR
Sensitizer geht nach Anregung in Triplett-Zustand
Anregung von Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff
• Halbwertszeit 4 µs, Diffusion ca. 200 nm
s. Photodynamische Therapie (FoscanR, MetvixR)
Hier: Phthalocyanine
Prof. Dr. Manfred Jung
15
AlphaScreenR
Akzeptorbead
Singulett-Sauerstoff-Akzeptoren, die unter Chemolumineszenz
zerfallen
N
N
S
N
1O
2
O
Thioxen
S
O
O
O
S
O
O
O
+ h.
Dioxetan
Prof. Dr. Manfred Jung
Probleme von HTS
Substanzbibliotheken
Größe
Diversität vs. Fokussierung
Reinheit
Nachschub
Aufbewahrung
Konfektionierung
Prof. Dr. Manfred Jung
16
Probleme von HTS
Targetprotein
Menge
Stabilität
Veränderte Ligandenbindung in-vitro ?
Automatisierung von Reagenzzugabe und Readout
v.a. bei Miniaturisierung problematisch
Dosiergenauigkeit
Reproduzierbarkeit
Prof. Dr. Manfred Jung
Abbildungen
96-well
384-well
1536-well
3456-well
Prof. Dr. Manfred Jung
17
Vergleich Mikrotiterplatten
Plattentyp
96-well
384-well
1536-well
3456-well
Volumen
382 µl
138 µl
13 µl
2,4 µl
Arbeitsvolumen
25-340 µl
10-130 µl
3-10 µl
0,8-2,3 µl
Durchmesser Well
6,96 mm
3,7 mm
1,7 mm
1,1 mm
1,0 mm²/µl
2,2 mm²/µl
4,9 mm²/µl
Verhältnis
Oberfläche/Volumen 0,7 mm²/µl
Prof. Dr. Manfred Jung
18