Chlamydia trachomatis - medac

Chlamydia trachomatis
PCR Kit
Zur in-vitro Diagnostik
Das Kit ist für den Einsatz in spezialisierten PCR-Laboratorien vorgesehen.
Kit-Inhalt
Kat.-Nr.
MASTERMIX
Chlamydia trachomatis
Internal Standard zur Inhibitionskontrolle ist bereits
im MasterMix enthalten
CHT/ISIN/025
CHT/ISIN/050
CHT/ISIN/100
25 Reaktionen
50 Reaktionen
100 Reaktionen
Enthält ein separates Reaktionsgefäß Internal Standard
zur Inhibitions- und Extraktionskontrolle
CHT/ISEX/025
CHT/ISEX/050
CHT/ISEX/100
25 Reaktionen
50 Reaktionen
100 Reaktionen
1 x 750 μl
2 x 750 μl
4 x 750 μl
1 x 750 μl
2 x 750 μl
4 x 750 μl
1 x 200 μl
1 x 200 μl
2 x 200 μl
1 x 200 μl
1 x 200 μl
2 x 200 μl
-
-
-
1 x 1000 μl
1 x 1000 μl
2 x 1000 μl
POSITIVE CONTROL
Chlamydia trachomatis
102 copies/μl
INTERNAL STANDARD
Chlamydia trachomatis
Lagerungs- und Transportbedingungen
Die Transporttemperatur der Kits sollte -20°C bis -80°C betragen. Die Haltbarkeit des Kits beträgt bei korrekter Lagerung (-20°C) 9
Monate nach Herstellungsdatum. Wiederholtes Einfrieren und wieder Auftauen von MasterMix, Positive Control und Internal Standard
führt zu verminderter Nachweisqualität. Daher wird empfohlen, den MasterMix in 30 µl Aliquots in PCR Reaktionsgefäße bei -20°C zu
lagern. Positive Control und Internal Standard können bei 4°C gelagert werden.
Hersteller: GeneProof a.s., Viniční 235, 615 00 Brno, Czech Republic
Phone/Fax.: +420 543 211 679, e-mail: [email protected], www.geneproof.com
Ausgabedatum: 21.12.2009
VERSION--03
Informationen zum Erreger
Chlamydia trachomatis ist ein weit verbreiteter intrazellulärer Erreger, der die Schleimhäute im urogenitalen System, Rektum, Nasopharynx
und Konjunktiva infiziert. Assoziierte Krankheitsbilder sind u.a. nicht-gonorrhoische Urethritis, Zervizitis, Lymphogranuloma Venerum,
Prostatitis, Konjunktivitis und das Trachom. C. trachomatis ist einer der häufigsten Erreger sexuell übertragbarer Erkrankungen (STD).
Die Serovare D-K gehören zu den häufigsten Erregern, die Entzündungen des urogenitalen Systems verursachen. In den entwickelten
Ländern sind 50% aller urogenitalen Infektionen auf diesen Erreger zurückzuführen. Bei Männern ist C. trachomatis die Hauptursache der
sogenannten nicht-blenorrhagischen oder post-blenorrhagischen Urethritis. Bei Frauen wird häufig die Zervix infiziert, mit den
Spätfolgen der Tubenfaktor-Infertilität oder Zervixtumore. Da die Infektion symptomlos verlaufen kann, wird die rechtzeitige
Diagnostik oft verhindert, aber die weitere Übertragung forciert. Eine genaue Diagnostik ist die Voraussetzung für die Einleitung einer
effizienten Therapie, in der Regel mit Makroliden, Tetrazyclinen oder Chinolonen. Die Diagnostik akuter Chlamydieninfektionen litt
bisher unter dem Zeitaufwand der klassischen Kultur und der verzögerten Antikörperantwort. Methoden zum Nachweis der
Chlamydien-DNA sind daher das Mittel der Wahl. Bei akuten Chlamydieninfektionen des Urogenitalsystems und des Auges zeigen hoch
sensitive und spezifische PCR-Methoden eine 20-30% bessere Empfindlichkeit im Vergleich zu konventionellen Methoden. Auch zum
Nachweis von Chlamydien-Kontaminationen in Samenspenden für die In-vitro-Fertilisation (IVF) ist die PCR sehr gut geeignet.
Methode
Das Kit dient zum Nachweis von Chlamydia trachomatis genomischer und Plasmid-DNA mittels real-time PCR. Der Nachweis von C.
trachomatis erfolgt durch Amplifikation der Zielsequenzen aus dem 16S RNA Gen und einer spezifischen Sequenz auf dem kryptischen
Plasmid und durch die Messung des Konzentrationsanstiegs des Amplifikationsproduktes im PCR-Lauf mittels einer Fluoreszenzmarkierten Sonde. Die Anwesenheit von C. trachomatis-DNA in der Probe wird durch den Fluorezenzanstieg des FAM Fluorophors
angezeigt. Im Reaktionsmix ist ein interner Standard (Internal Standard, IS) enthalten, um inhibitorische Substanzen im PCR-Ansatz
nachzuweisen und die Effizienz der DNA-Extraktion zu kontrollieren. Eine positive IS-Amplifikation wird im Fluoreszenzkanal des
JOE Fluorophors angezeigt. Das Nachweiskit nutzt den Vorteil der „hot start“ Technologie. Dadurch werden unspezifische Reaktionen
minimiert und eine maximale Sensitivität erreicht. Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) verhindert potentielle Kontamination der PCRReaktion durch Amplifikationsprodukte. Dadurch wird eine sehr hohe Sensitivität des labortechnischen C. trachomatis-Nachweises aus
klinischen Proben gesichert. Das Kit dient zur in-vitro Diagnostik und ermöglicht qualitative Ergebnisse.
GeneProof PCR Kits können auf viele real-time Systeme verschiedener Hersteller eingesetzt warden.
Das PCR Kit ist mit folgenden Geräten validiert:
Rotor-GeneTM 3000 (Corbett Life Science)
Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Life Science)
Mx3005P®QPCR System (Stratagene)
Mx3000P®QPCR System (Stratagene)
7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)
7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)
LightCycler® 2.0 (Roche)
LightCycler® 480 System (Roche)
SLAN Real-time Quantitative PCR Fluorescent Detection System (Shanghai Odin Science & Technology Co.)
Weitere Informationen zum Einsatz der PCR Kits auf den oben genannten Geräten finden Sie auf der Homepage des
Herstellers (www.geneproof.com) oder erhalten Sie über medac Diagnostika www.medac.de
Zu Informationen zum Einsatz auf anderen real-time Geräten kontaktieren Sie bitte: [email protected] oder
[email protected]
Hinweise:
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Das Kit ist nach den Richtlinien der EU Direktive 98/79/EEC on in vitro medical diagnostic device hergestellt.
Die Positive Kontrolle und klinisches Probenmaterial bitte mit Vorsicht behandeln, um Kontaminationen und Schädigung der
Testkomponenten oder des MasterMix zu vermeiden. Der Hersteller haftet nicht für Schäden infolge von Anwendungsfehlern.
Die nationalen verbindlichen Arbeitsschutzvorschriften sind zu beachten.
Die in diesem Produkt enthaltenen Chemikalien und Zubereitungen sowie die bei der Anwendung anfallenden Reste sind in der
Regel Abfälle, die einer ordnungsgemäßen Entsorgung zugeführt werden müssen. Die Entsorgung solcher Abfälle unterliegt den
nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständigen Behörde oder Abfallbeseitigungsunternehmen
informieren über die Entsorgung von Sonderabfällen.
Testdurchführung
Probenentnahme und Lagerung
Zum Chlamydiennachweis bei urogenitalen Infektionen sollte mittels kräftigen Epithelabstrich so viel Zellmaterial wie möglich
gewonnen werden. Von Frauen mit urogenitaler Infektion sollte nach Möglichkeit sowohl ein Zervixabstrich als auch ein
Urethraabstrich entnommen werden. Beim urethralen Abstrich soll der Tupfer schraubenförmig 3-4 cm eingeführt werden. Der
Patient sollte ca. 2 Stunden vor der Probenentnahme kein Wasser lassen. Für Urinproben werden die ersten 10-30 ml genommen
(Morgenurin ist nicht erforderlich). Für den Nachweis von Chlamydien-Kontaminationen in Samenspenden sind mindestens 200 µl
Ejakulat erforderlich. Bei Augeninfektionen werden Tränenflüssigkeit aus dem Konjunktivalsack oder Cornea-Abstriche verwendet.
Die Probenentnahme sollte in sterile Röhrchen ohne jegliche Transportmedien und der Probentransport innerhalb von 24 Stunden
bei +4°C erfolgen. Für die Langzeitlagerung müssen alle Proben bei -20°C eingefroren werden.
DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion kann mit kommerziell erhältlichen Extraktions-Kits unter Beachtung der spezifischen Protokolle für den in
Frage kommenden Erreger erfolgen. Der Hersteller empfiehlt das PathogenFree DNA isolation Kit (GeneProof) oder Arrow
BUGS’ n BEADSTM (NorDiag).
Zur Überwachung auf eventuelle Inhibitoren im PCR-Ansatz und der Effizienz der Extraktion enthalten alle GeneProof PCR Kits
einen internen Standard (IS). Der interne Standard ist ein präzise definiertes und quantifiziertes Plasmid mit Insert, hergestellt nach
einem gentechnischen Verfahren. GeneProof hat PCR-Kits für zwei Basisversionen mit unterschiedlichem Konzept für den
internen Standard entwickelt.
PCR Kit ISIN (Cat. No. CHT/ISIN...)
In dieser PCR-Kitversion ist der interne Standard (IS) schon direkt im MasterMix Reaktionsgefäß enthalten. Diese Kitversion bietet
eine effiziente Kontrolle potentieller Inhibitoren der PCR-Reaktion.
PCR Kit ISEX (Cat. No. CHT/ISEX...)
Die Packung dieser PCR-Kitversion enthält den internen Standard (IS) in einem separaten Reaktionsgefäß. Mit dieser Kitversion
können sowohl potentielle Inhibitoren der PCR-Reaktion als auch die Effizienz der DNA-Extraktion kontrolliert werden.
Wird die ISEX PCR-Kitversion verwendet, muss der IS zu Beginn des Extraktionsprozesses direkt in die Probe gegeben
werden, so dass am Ende 1 µl des resultierenden Elutionsvolumen 0.1 µl IS enthält:
Elutionsvolumen
Internal Standard
25 µl
2.5 µl
50 µl
5 µl
100 µl
10 µl
200 µl
20 µl
PCR Kit ISIN
PCR Kit ISEX
Probe
Probe
Internal Standard
0.1µl IS per 1µl Elutionsvol.
DNA Extraktion
extrahierte DNA
30 µl MasterMix
+
10 µl DNA
PCR Amplifikation
JOE
Fluores cenc y
Fluores cenc y
JOE
4
3
2
1
0
2
8 14 20 26 32 38 44 50
Cy cle number
PCR Inhibitionskontrolle
4
3
2
1
0
2
8 14 20 26 32 38 44 50
Cy cle number
Kontrolle auf PCR Inhibition
und DNA Extraktion
PCR Amplifikation
1.
2.
30 l MasterMix und 10 l extrahierte DNA oder 10 l Positive Control in ein PCR Reaktionsgefäß pipettieren.
Das Endvolumen des Reaktionsmixes beträgt 40 l.
Das Reaktionsgefäß verschließen, kurz zentrifugieren, in den Cycler setzen und diesen wie folgt programmieren:
Amplifikations-Programm:
UDG decontamination
initial denaturation
37°C/2 min.
95°C/15 min.
denaturation
annealing
extension
number of cycles
95 °C/10 sec.
60°C/60 sec. - reading of the fluorescence signal
72°C/40 sec.
45
Qualitative Auswertung der PCR-Reaktion
FAM
JOE
Internal Standard
4
Fluorescency
Fluoresc enc y
Chlamydia trachomatis
3
2
1
0
4
3
1
0
2
Fluorescency
4
3
negativ
2
1
0
2
Fluorescency
0,4
0,2
0
8 14 20 26 32 38 44 50
Cycle number
Cycle number
1
0,8
0,6
8 14 20 26 32 38 44 50
Cycle number
2 8 14 20 26 32 38 44 50
Fluorescency
Fluorescency
Cycle number
0,4
0,2
0
positiv
2
2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50
1
0,8
0,6
Ergebnis
1
0,8
0,6
invalides
Ergebnis
0,4
0,2
0
2 8 14 20 26 32 38 44 50
2 8 14 20 26 32 38 44 50
Cycle number
Cycle number